Dióxido de cloro en covid19: hipótesis sobre el posible mecanismo de acción molecular en el SARS-CoV-2
Dióxido de cloro en Covid-19:
Hipótesis sobre el posible mecanismo de acción molecular en el SARS-CoV-2
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Insignares-Carrione, Eduardo. MD * (1) Director global de investigación de LVWWG Liechtensteiner Verein für Wissenschaft und Gesundheit, Suiza-Liechtenstein, 2020. Esta dirección de correo electrónico está siendo protegida contra los robots de spam. Necesita tener JavaScript habilitado para poder verlo.
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Bolano Gómez, Blanca. Doctor en Medicina (2) Esta dirección de correo electrónico está siendo protegida contra los robots de spam. Necesita tener JavaScript habilitado para poder verlo.Esta dirección de correo electrónico está siendo protegida contra los robots de spam. Necesita tener JavaScript habilitado para poder verlo.
Kalcker, Andreas Ludwig (3) Investigador Swiss SVNB Biphysic Director ejecutivo Liechtensteiner
Verein für die Wissenschaft und Gesundheit
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* autor correspondiente (1) (+34) 666667180
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Citación:
Insignares- Carrione E, Bolano Gomez B, Kalcker Andreas. (2020).
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Derechos de autor: © 2020 Insignares - Carrione et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales. A definir por el editor.
Fondos: Este trabajo fue apoyado con recursos propios de los investigadores.
Conflicto de intereses: Kalcker, Andreas declara un posible interés financiero ya que es inventor de la patente suiza pendiente / 11136-CH. Los otros dos autores no tienen intereses económicos en competencia. Esto no altera la adherencia de los autores a todas las políticas sobre el intercambio de datos y materiales.
Introducción
El ClO2, el llamado "biocida ideal", también podría aplicarse como virucida si se entendiera cómo la solución mata los virus rápidamente sin causar ningún daño a humanos o animales. Nuestro objetivo fue encontrar el mecanismo de acción de esta selectividad mediante el estudio de su mecanismo de reacción con la estructura del SARS-CoV-2 tanto teórica como experimentalmente, mediante simulación in sílico.
Métodos
Se realizaron revisiones extensas de investigaciones previas sobre el mecanismo de acción del ClO2 en virus, particularmente en sars-cov y virus de la influenza a nivel de aminoácidos componentes y carbohidratos especialmente en el pico viral, y estos datos se transfirieron a aminoácidos estructurales de SARS-CoV-2 virus, particularmente aquellos en posiciones críticas dentro del spike de SARS-CoV-2. Los datos preliminares de la simulación in sílico y los datos iniciales de nuestros ensayos clínicos de uso de Cl02 en covid19 por vía oral que se encuentran en proceso, permiten calcular en qué aminoácidos actúa, determinar los sitios de acción del ClO2 y estimar las acciones como virucida en SARS-CoV-2, basado en ecuaciones de reacción-difusión demostradas en estudios previos. Usamos reconstrucciones 3D realizadas por computadora, uso de datos a través de estudios en criomicroscopía electrónica y trabajos previos basados en software ChimeraX (UCSF) de realidad aumentada.
Discusión.
Determinar las posiciones de los aminoacidos susceptibles de ser oxidados por el dioxido de cloro permite proyectar su posible mecanismo de acción sobre el virus SARS-CoV-2 . La cisteina en posiciones Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 y Cys391-Cys525 estabilizan las cinco hojas beta (β1, β2, β3, β4 y β7), y Cys480-Cys488 es clave en la unión entre la cresta del SARS-CoV-2
RBM y la hélice N-terminal de hACE2 .Es claro que, sólo a éste nivel, la oxidación de estos residuos de cisteina produciria un efecto desestabilizador y danaturalizante de las hojas beta del virus.
Resultados
La proyección y simulación de la oxidación del dioxido de cloro en los aminoácidos estructurales del SARS-CoV-2 sobre los que ejerce esta acción, a mas de su numero (54 tyrosine, 12 tryptophan, 40 residuos de cysteine, ademas de prolina ), permite formarse una idea muy clara de los sitios en los que ejerce una accion denaturalizante el dioxido sobre la estructura viral y sobre el ACE2 humano. Aplicados los hallazgos de velocidad de reacción y difusión del dioxido sobre estos aminoacidos, es posible comprender la extrema rapidez con la que actúa, lo cual podria explicar los primeros hallazgos de estudios observacionales clinicos del uso del dioxido de cloro en covid19 realizados por los autores en Bolivia bajo estricto cumplimiento de comité de ética.
Conclusión
El conocer la disposicion de los sitios en los que están ubicados los aminoacidos sensibles a la oxidación por el dioxido de cloro en la proteina del spike del coronavirus SARS-CoV-2 la cual contiene 54 tyrosine, 12 tryptophan, 40 residuos de cysteine, ademas de prolina presente en la estructura del ACE2 en conexión con el RBD, pemite proyectar las acciones del dioxido sobre el spike viral.Esperamos publicar ensayos de aplicaciones clínicas de este prometedor virucida sistémico pronto.
Introducción:
Covid-19 es una enfermedad infecciosa causada por el virus SARS-CoV-2. Se detectó por primera vez en la ciudad china de Wuhan (provincia de Hubei) en diciembre de 2019. En tres meses se extendió a prácticamente todos los países del mundo, motivo por el cual la Organización Mundial de la Salud lo declaró pandemia. (OMS, 11 de marzo de 2020).
No existe un tratamiento específico; las principales medidas terapéuticas son aliviar los síntomas y mantener las funciones vitales. La investigación para encontrar un tratamiento eficaz comenzó desde que se verificó la escala pandémica de la enfermedad. El problema central es que, once meses después de su inicio oficial, se desconoce un tratamiento eficaz para la enfermedad. Ante la falta de un tratamiento eficaz, estudiamos nuevas posibilidades terapéuticas con la intención de encontrar un tratamiento eficaz y seguro para el covid19.
De acuerdo con lo anterior, esta investigación aborda los resultados actuales e investigaciones previas [1] adicionando la posible acción terapéutica como virucida del dióxido de cloro en solución acuosa y sin presencia de clorito de sodio utilizando los conceptos de la medicina traslacional [2] basados en el conocimiento sobre la estructura del virus y del mecanismo de accion del dioxido de cloro en virus, para plantear un posible tratamiento de elección del covid19.
Dióxido de cloro
La acción del dióxido de cloro viene dada por su selectividad por el pH(3) y por la zona o tamaño donde genera su acción . Significa que esta molécula se disocia y libera oxígeno cuando entra en contacto con otro ácido. Al reaccionar, su átomo de cloro se une al sodio en el medio y se convierte en cloruro de sodio (sal común) liberando oxígeno, que oxida los patógenos de pH ácido presentes, convirtiéndolos en óxidos alcalinos. Por lo tanto, cuando el dióxido de cloro se disocia, libera oxígeno a la sangre, como lo hacen los eritrocitos (glóbulos rojos) mediante el mismo principio (conocido como efecto Bohr), que es el de ser selectivo para la acidez.
Como sucede normalmente en la sangre, el dióxido de cloro libera oxígeno cuando se encuentra con un suelo ácido, ya sea ácido láctico o la acidez del patógeno. Se postula su posible efecto terapéutico debido, entre otros efectos, a que crea un ambiente alcalino, al tiempo que elimina pequeños patógenos ácidos, por oxidación, con una sobrecarga electromagnética imposible de disipar por organismos unicelulares. El tiempo de muerte en un virus debe ser análogo al tiempo de demora causado por la reacción química, debido a los tiempos requeridos para copar todo el volumen. Podemos esperar que en un virus con un diámetro de 120 nanómetros, el tiempo de destrucción sea mucho más corto debido a su factor geométrico.
Según los estudios de Zoltán Noszticzius, el dióxido de cloro es un agente antimicrobiano selectivo por tamaño que puede matar rápidamente organismos del tamaño de un micrómetro, pero no puede causar un daño real a organismos mucho más grandes como animales o humanos, ya que no puede penetrar profundamente en sus tejidos.
Se sabe que el tejido multicelular tiene la mayor capacidad para disipar cargas eléctricas y por lo tanto no se ve afectado de la misma forma por los voltajes del proceso de oxidación-reducción (ORP) como es el caso de los organismos unicelulares y por tanto existe bioquímicamente mayor protección celular por tamaño.
El dióxido de cloro, que es el desinfectante no citotóxico más efectivo conocido después del ozono, y utilizado como solución acuosa tiene inmensas posibilidades de ser utilizado terapéuticamente ya que también es capaz de penetrar y eliminar el biofilm (3), que el ozono no logra hacer. La gran ventaja del posible uso terapéutico del dióxido de cloro en infecciones es la imposibilidad de una resistencia bacteriana o viral al ClO2 ya que actúa por el mecanismo de oxidación y no como el cloro (Cl2) por cloración (3)
Aunque el ozono es más fuerte en términos antisépticos, su alto potencial oxidativo de 2,07 y su corta vida media de sólo 15 minutos a 25 ° C con un valor de pH de 7,0 lo hace menos eficaz que el ClO2 para aplicaciones terapéuticas in vivo. El dióxido de cloro es un oxidante selectivo por pH (-) y tamaño y, a diferencia de otras sustancias, no reacciona con la mayoría de los componentes del tejido vivo (3). El dióxido de cloro reacciona rápidamente con fenoles y tioles esenciales para la vida bacteriana.
En los fenoles el mecanismo consiste en atacar el anillo bencénico, eliminando el olor, el sabor y otros compuestos intermedios (4). El dióxido de cloro elimina los virus de forma eficaz y es hasta 10 veces más eficaz (5) que el hipoclorito de sodio (lejía o lejía). También se demostró que es muy eficaz contra pequeños parásitos, protozoos (4).
Un tema que se ha revisado mucho últimamente es la reactividad del dióxido de cloro con los aminoácidos. En las pruebas de reactividad del dióxido de cloro con 21 aminoácidos, solo cisteína4, triptófano5, tirosina6, prolina e hidroxiprolina reaccionaron a un pH de alrededor de 6. La cisteína y la metionina (4) son dos aminoácidos aromáticos que contienen azufre, triptófano y tirosina y los dos iones inorgánicos Fe2 + y Mn2 +. (3) La cisteína, debido a su pertenencia al grupo de los tioles, es un aminoácido hasta 50 veces más reactivo con todos los sistemas microbianos que los otros cuatro aminoácidos y, por lo tanto, es imposible que cree una resistencia contra el dióxido de cloro.
La hipótesis que proponemos aquí es que la causa del efecto antiviral del dióxido de cloro puede explicarse debido a sus acciones sobre, al menos, cinco aminoácidos enumerados anteriormente o sobre residuos de péptidos.
El dióxido de cloro (ClO2) se utiliza desde 1944 en el tratamiento del agua potable por su poder biocida, así como en la mayoría de las aguas embotelladas aptas para el consumo por su casi nula falta de toxicidad en solución acuosa (3,4) siendo utilizado sistemáticamente en la desinfección y conservación de bolsas de transfusión de sangre (4). Al ser un oxidante selectivo (3,4) su modo de acción es muy similar al de la fagocitosis, donde se utiliza un proceso de oxidación suave para eliminar todo tipo de patógenos.
El dióxido de cloro (ClO2) es un gas amarillento que a la fecha, no forma parte de la farmacopea convencional como medicamento a pesar de su probada eficacia en la desnaturalización de virus, con múltiples patentes de uso en diferentes tratamientos como la desinfección o esterilización de componentes de la sangre (glóbulos, proteínas sanguíneas, etc.) 4, el tratamiento parenteral (vía intravenosa) de infecciones por VIH (4), o para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Alzheimer (4) y otras patentes para usos como patentes para: tratamiento del cáncer por inducción de apoptosis (CN 103720709
A) tratamiento de tumores (US 10, 105, 389 B1) Tratamiento antiviral de la sinusitis (US 2o16 / 0074432 A1), Estimulación del sistema inmunológico (US 5,830,511), inicio y diferenciación de células madre (WO2014082514A1), Método de tratamiento vaginal (US 6280716B1), Tratamiento de la piel contra virus y bacterias (US 4,737,307), Método para tratar la amebiasis en humanos (US 4,296,102), Tratamiento contra infecciones por candidiasis (US 2015/0320794 A1) , Tratamiento de heridas (US 87.3106), Tratamiento de cavidades bucales (US 100015251), (US4689215), Contra inflamaciones (US53841134), Tratamientos contra hongos en las uñas (US 20100159031) y Patente suiza pendiente / 11136-CH.(Kalcker, A.).
Con base en lo anterior se pueden establecer tres premisas:
El dióxido de cloro puede combatir los virus mediante el proceso de oxidación selectiva al desnaturalizar las proteínas de la cápside y la posterior oxidación del material genético del virus, dejándolo inhabilitado. Al no existir una posible adaptación al proceso de oxidación, imposibilita el desarrollo de resistencias por parte del virus, haciendo del dióxido de cloro (ClO2) un tratamiento prometedor para cualquier subespecie viral.
Existe evidencia científica de que el dióxido de cloro es eficaz contra el coronavirus SARS- CoV(4) y SARS-CoV-2 , como el trabajo realizado en la universidad de queretaro en Mexico y publicado en noviembre de 2020 COVID-19 , denominado “Evaluación in vivo del efecto antiviral del ClO2 (dióxido de cloro) en embriones de pollo inoculados con el coronavirus aviar (IBV), en el cual el tratamiento con ClO2 tuvo un marcado impacto en la infección de IBV. A saber, los títulos virales fueron 2,4 veces más bajos y la mortalidad se redujo a la mitad en los embriones infectados que fueron tratados con ClO2. La infección provocó anomalías en el desarrollo independientemente del tratamiento. Se observaron lesiones típicas de las infecciones por IBV en todos los embriones inoculados, pero la gravedad tendía a ser significativamente menor en los embriones tratados con ClO2. No se encontraron pruebas macro o microscópicas de la toxicidad causada por el ClO2 a las dosis utilizadas. (50).
Toxicidad: Los mayores problemas que surgen con fármacos o sustancias que pueden considerarse como tales en general se deben a su toxicidad y efectos secundarios. Existe toxicidad con el dióxido de cloro en caso de inhalación via respiratoria, mas no hay reportes de toxicidad a la dosis recomendada de 30 mgrs o 30 ppm en solución acuosa vía oral y ninguna muerte clínicamente probada incluso a dosis altas por ingestión oral. La dosis letal (DL50, relación de toxicidad aguda) se estima en 292 mg por kilo durante 14 días, donde su equivalente en un adulto de 50 kg sería de 15.000 mg administrados durante dos semanas. Las dosis orales sub-tóxicas que se pueden utilizar son de aproximadamente 50 ppm disueltas en 100 ml de agua 10 veces al día, lo que equivale a 500 mg. Además, el dióxido de cloro, al disociarse, se descompone en un ión de cloro que se asocia inmediatamente con el ión de sodio, formando sal común NaCl y oxígeno O2 dentro del cuerpo humano. En resumen, el dióxido de cloro a las dosis recomendadas en el covid19 de 30 mgrs o 30 ppm por dia no son tóxicas .
Efectos virucidas del dióxido de cloro
El dióxido de cloro es un agente antimicrobiano eficaz que mata bacterias, virus y algunos parásitos [9]. Su perfil germicida de amplio espectro se deriva de la acción de este compuesto como oxidante no citotóxico.
Los virus generalmente están constituidos por una capa externa o una cubierta de proteína que encapsula un ácido nucleico, que puede ser ADN o ARN. Cuando el dióxido de cloro entra en contacto con un virus, se libera un solo átomo de oxígeno naciente altamente reactivo sobre el virus objetivo. Este oxígeno se une a aminoácidos específicos en la cubierta proteica del virus, desnaturalizando las proteínas y volviendo al virus inactivo. Además, los átomos de oxígeno nacientes se unen a la guanina, una de las cuatro bases de ácido nucleico que se encuentran en el ARN y el ADN, formando 8-oxoguanina. Esta oxidación de los residuos de guanina evita la replicación del ácido nucleico viral [10].
En la literatura científica publicada hay reportes que el dióxido de cloro inactiva una amplia variedad de virus, incluyendo influenza A [11], adenovirus humano [12], rotavirus humano [13], echovirus [14], bacteriófago f2 [15] y poliovirus [16].
Los virus de la influenza A son virus de ARN esféricos, de sentido negativo, monocatenario que poseen una membrana lipídica que contiene picos compuestos por glicoproteínas conocidas como HA (hemaglutinina) y NA (neuraminidasa). Dentro del virus hay ocho hebras simples de ARN [17]. Un estudio preclínico [11] encontró que el dióxido de cloro gaseoso es eficaz para prevenir la infección por el virus de la influenza A inducida por aerosoles. Este estudio utilizó concentraciones bajas de dióxido de cloro gaseoso (es decir, 0,03 ppm) en una jaula de ratón. Este nivel está por debajo del nivel de exposición a largo plazo permitido por OSHA (8 horas) para gas de dióxido de cloro en el aire ambiente en un lugar de trabajo humano, que es de 0,1 ppm [18]. El gas de dióxido de cloro redujo efectivamente el número de virus infecciosos en los pulmones de los ratones y redujo notablemente la mortalidad. La mortalidad fue del 70% (7/10) el día 16 en el grupo no tratado con dióxido de cloro y del 0% (0/10) en el grupo tratado con dióxido de cloro. Los autores confirmaron estos resultados repitiendo su experimento. Los
resultados del estudio repetido fueron 50% (5/10) de mortalidad en el grupo no tratado y 0% (0/10) en el grupo tratado.
Los autores concluyeron que los niveles bajos de dióxido de cloro gaseoso (es decir, 0,03 ppm), que están por debajo del nivel de exposición permisible en los lugares de trabajo humanos, "podrían usarse en presencia de humanos para prevenir su infección por el virus de la influenza A y posiblemente otros virus relacionados con infecciones del tracto respiratorio (p. 65).Sugirieron que "el gas de dióxido de cloro podría usarse en lugares como oficinas, teatros, hoteles, escuelas y edificios de aeropuertos sin evacuar a las personas, sin interrumpir sus actividades normales"
Los autores sugirieron que su método "abre un nuevo camino para la prevención de la influenza pandémica", (p. 65) luego de realizar un estudio en una escuela con resultados favorables al respecto.
Se descubrió que la infectividad del virus se reduce in vitro mediante la aplicación de dióxido de cloro, y concentraciones más altas producen reducciones aún mayores. Esta inhibición de la infectividad se correlacionó con alteraciones en proteínas virales. Estas alteraciones resultaron de la incorporación de átomos de oxígeno en los residuos de triptófano y tirosina ubicados en las proteínas HA y NA [11]. Estas proteínas se desnaturalizan mediante la adición de átomos de oxígeno, lo que elimina la capacidad del virus para infectar otras células [19]. Un estudio posterior encontró que la inactivación del virus de la influenza A es causada por la transferencia de 2 átomos de oxígeno del dióxido de cloro a un residuo específico de triptófano (W153) en la proteína de la punta de hemaglutinina (HA).
Los adenovirus son virus sin envoltura con una cápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN bicatenario. Se han clasificado siete grupos de adenovirus humanos [21]. Un estudio reciente encontró que el dióxido de cloro puede ayudar a reducir los niveles de adenovirus en el agua potable [12]. Este estudio examinó los efectos del dióxido de cloro y la luz ultravioleta sobre los niveles de adenovirus en el agua potable en los Países Bajos. Los autores encontraron
que la aplicación de dióxido de cloro en concentraciones bajas (0.05 - 0.1 ppm) redujo los adenovirus en el agua potable, mientras que la desinfección UV fue insuficiente sin la desinfección con dióxido de cloro.
Los rotavirus son virus de ARN bicatenario que constan de 11 moléculas de ARN bicatenarias únicas rodeadas por una cápside proteica icosaédrica de tres capas [22]. Estos virus, que son la principal causa de enfermedades diarreicas graves en lactantes y niños pequeños en todo el mundo [23], son inactivados por el dióxido de cloro. De hecho, a concentraciones de dióxido de cloruro que oscilan entre 0,05 y 0,2 ppm, se inactivan en 20 segundos in vitro [24].
El bacteriófago f2 es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo que infecta a la bacteria Escherichia coli. Un estudio in vitro encontró que 0,6 mg / litro de dióxido de cloro rápidamente (es decir, en 30 segundos) inactivaba el bacteriófago f2 e interfería con su capacidad para unirse a su huésped, E. coli [15]. Tanto la inactivación del virus como la inhibición de su capacidad para unirse a su huésped aumentaron con un pH más alto y con concentraciones crecientes de dióxido de cloro. Además, los autores encontraron que el dióxido de cloro desnaturaliza las proteínas de la cápside del virus al reaccionar con residuos de tirosina, triptófano y cisteína. Estos aminoácidos se degradaron casi por completo a los 2 minutos de exposición al dióxido de cloro.
El poliovirus es un virus de ARN de cadena positiva y sentido positivo [25]. Ridenour e Ingerson [26] descubrieron que el dióxido de cloro puede inactivar el virus de la polio in vitro. Posteriormente, Álvarez y O'Brien [16] ampliaron este trabajo al mostrar que el tratamiento con 1 ppm de dióxido de cloro in vitro da como resultado la separación del ARN de la cápside y también produce alteraciones en el ARN.
Además de los estudios mencionados anteriormente, la Agencia de Protección Ambiental de los EE. UU. (EPA), que el 10 de abril de 2020 incluyó al dióxido de cloro como un desinfectante registrado por la EPA para eliminar el virus SARS-CoV-2, brinda apoyo adicional
para los efectos virucidas de cloro [27]. El sitio web de la EPA indica que este producto es para uso superficial y no para uso humano.
Aún no se han realizado estudios en humanos sobre los efectos del dióxido de cloro en el virus SARS-CoV-2. Actualmente, dos de los autores (Insignares y Bolano) están realizando el primer ensayo clínico multicéntrico en el mundo sobre la efectividad en humanos del dióxido de cloro por vía oral en covid19 (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT04343742). Un estudio in vitro encontró que el dióxido de cloro inactiva el virus SARS-CoV genéticamente relacionado [28]. Se encontró que una concentración de 2,19 mg / litro de dióxido de cloro causaba la inactivación completa del SARS-Co-V en las aguas residuales. Una rama de nuestro grupo está en proceso de realizar una investigación in vitro de la acción del dióxido de cloro sobre el SARS-CoV-2 en India y tenemos en proceso de publicación un informe de la simulación del mecanismo de acción del dioxido de cloro en el SARS-Co-V-2 mediante el metodo de in sílico, realizada en Japón.
En Ecuador (Aememi. Dióxido de cloro: una terapia eficaz para el tratamiento del covid 19; 51) se realizó un ensayo preliminar con la administración de dióxido de cloro por vía oral con 104 pacientes con covid19 que tenían perfiles variables en cuanto a edad, sexo y gravedad de la enfermedad, diagnosticada la minoría mediante prueba y la mayoría mediante cribado según la sintomatología típica de la enfermedad. Por ello, los datos fueron manejados mediante una escala de puntuación sintomatológica, siendo 10 la percepción máxima y 0 la mínima del síntoma: fiebre, escalofríos, dolor muscular, tos seca, dolor de cabeza, dolor de espalda, dificultad para respirar, vómito, diarrea. , dolor de garganta, pérdida del olfato, pérdida del sabor, falta de apetito.
Se recomendó dióxido de cloro en concentración de 3000 ppm a una dosis de diez cc diluidos en un litro de agua, tomados a lo largo del día, divididos en 10 tomas diarias, en dosis cada hora y media durante 20 días.
Los resultados se distribuyeron según los síntomas después del primer día de tratamiento, segundo, tercero y cuarto. Se segmentaron entre hombres y mujeres, y también se presentaron resultados comunes.
Los siguientes cuadros muestra los síntomas, y en el primer y último gráfico el comportamiento en relación a la escala sintomatológica entre el primer y cuarto día de ingesta de dióxido de cloro oral.
Cuadro 1 : Resultado del dioxido de cloro al dia 1 de su administración
Cuadro 2 : Resultado del dioxido de cloro al dia 4 de su administración
De este estudio preliminar se pueden extraer las siguientes conclusiones: El dióxido de cloro es definitivamente inofensivo -no tóxico en absoluto- en las dosis recomendadas e ingeridas y todos los síntomas iniciales comenzaron a disminuir desde el primer día de tratamiento, siendo la disminución totalmente evidente en el cuarto día. Específicamente, los síntomas más indicativos de una infección en curso, como fiebre, escalofríos, dolor de cabeza, dolor de garganta, pérdida del apetito y pérdida de los sentidos del gusto y el olfato, disminuyeron radicalmente. Otros síntomas, como el dolor muscular y la tos, siguieron siendo algo frecuentes, ya que tienden a permanecer residuales durante más tiempo después de que la enfermedad ha terminado.
Materiales y métodos:
Para la búsqueda de la información de referencia utilizada en este artículo, se revisaron los buscadores web utilizando los criterios MesH, de acuerdo con la estrategia de búsqueda señalada en líneas posteriores en los períodos comprendidos entre enero y abril de 2020, encontrando los siguientes resultados: 1. PubMed (Medline ): 4 referencias, 2. LILACS: 18 referencias, 3.
Biblioteca Cochrane: 56 referencias, 4. Ciencia: 1.168 referencias, 5. Scielo: 61 referencias, 6. MedScape: 19 referencias para un total de 1.326 publicaciones científicas cuyos contenidos fueron sobre el uso del dióxido de cloro en diferentes aplicaciones y sobre el mecanismo de acción del dióxido de cloro en los virus sars-cov y sars-cov2.
Finalmente, revisamos los registros en www.clinicaltrials.gov y los de la Plataforma Internacional de Registros de Ensayos Clínicos (ICTRP) de la OMS, con el fin de identificar ensayos clínicos en curso o aún no publicados.
Estrategia de búsqueda:
"Dióxido de cloro" O "Protocolo de dióxido de cloro" O Dióxido de cloro Y virus; Dióxido de cloro Y SAR-COV-2; O "tratamiento farmacológico COVID-19" O "glIcoproteína de spike, virus COVID-19" O "síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2" O "COVID-19" O "2019-
nCoV" O "SARS-CoV-2" O "2019 nuevo coronavirus "O" enfermedad por coronavirus 2019 "O (neumonía).
De los resultados de la búsqueda, seleccionamos aquellos que hacían referencia a la acción virucida del dióxido de cloro sobre diversos microorganismos, en particular sobre virus y, en ellos, el SARS-CoV-2 o el SARS-CoV.
Revisamos además los estudios realizados sobre la acción del dióxido de cloro sobre los aminoácidos, especialmente los que forman parte de las cápsides virales. De los hallazgos resaltamos que en 1986, Noss et al. demostraron que la inactivación del virus bacteriano (bacteriófago) f2 por el ClO2 [29] se debía a sus reacciones con las proteínas de la cápside viral. Adicionalmente, encontraron que tres aminoácidos de la proteína viral [29], a saber, cisteína, tirosina y triptófano, podían reaccionar con ClO2 rápidamente. En 1987, Tan y otros probaron la reactividad del ClO2 en 21 aminoácidos libres [30]. El ClO2 reaccionó con sólo seis aminoácidos disueltos en tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 6,0. La reacción con cisteína, triptófano y tirosina fue demasiado rápida para ser seguida por su técnica.
La reactividad de los tres aminoácidos de reacción rápida (cisteína [31], tirosina [32] y triptófano [33) se estudiaron en el laboratorio entre 2005 y 2008, encontrando que la cisteína tenía la mayor reactividad entre estos aminoácidos.
En 2007, Ogata [34] descubrió que la actividad antimicrobiana del ClO2 se basa en la desnaturalización de ciertas proteínas, que se debe principalmente a la modificación oxidativa de los residuos de triptófano y tirosina de las dos proteínas modelo (albúmina sérica bovina y glucosa -6- fosfato deshidrogenasa) utilizados en sus experimentos. En 2012, fue nuevamente Ogata quien demostró [35] que la inactivación del virus de la influenza por el ClO2 fue causada por la oxidación de un residuo de triptófano (W153) en hemaglutinina (una proteína de la espiga del virus), suprimiendo así su capacidad para unirse a los receptores..
En este contexto, es interesante observar que la proteína del spike del nuevo coronavirus SARS_CoV-2 contiene 54 residuos de tirosina, 12 de triptófano y 40 de cisteína [36].
Si asumimos que en una solución acuosa todos estos residuos de aminoácidos son capaces de reaccionar con el ClO2 así como con los aminoácidos libres, la inactivación del virus puede ser extremadamente rápida incluso en una solución de 0,1 mg / L de ClO2.
Por otro lado, seleccionamos los artículos que describen la acción del SARS-CoV-2 en las células, en su interacción con ACE2 y, en particular, investigamos videos de realidad aumentada o videos de simulación basados en Silico, para la representación tridimensional de sitios de acción como videos en el que la proteína espicular y el receptor ACE2 (37), entre otros, son manipulados con el software de realidad aumentada ChimeraX (UCSF). (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44).
De la misma manera, revisamos la estructura del spike del virus y nos basamos en la investigación de Daniel Wrapp y Jason S. McLellan en la Universidad de Texas.
La imagen tridimensional de la glicoproteína S espicular del betacoronavirus SARS-CoV-2 se ha visto con criomicroscopía electrónica en un tiempo récord. Gracias a esta imagen con una resolución de 3,5 Å, se confirma que esta proteína S se acopla a la proteína hACE2 de células humanas con una afinidad superior a la del coronavirus SARS-CoV. La proteína S es el objetivo de los anticuerpos que nos inmunizan. Su estructura 3D permite comprender por qué los anticuerpos monoclonales publicados contra el SARS-CoV no son efectivos contra el SARS- CoV-2. Sin duda, ayudará a acelerar el desarrollo de vacunas y terapias contra la infección por COVID-19. (45),
En estos videos de simulación y realidad virtual se observa que la proteína S es un trímero formado por tres péptidos, cada uno con dos subunidades S1 y S2. La subunidad S1 actúa como una bisagra con dos conformaciones llamadas "abajo" (RBD abajo) y "arriba" (RBD arriba). La formación de imágenes por criomicroscopía electrónica muestra que sólo uno de los péptidos está en el estado "arriba", mientras que los otros dos están en el estado "abajo". La unión al receptor celular ocurre en la configuración "ascendente". Después de la unión, los tres péptidos de la proteína S se escinden en el sitio S1 / S2; luego se produce una segunda escisión en el punto S2 ', que despliega el péptido de fusión clave (FP) en la unión entre las membranas.
Discusión
La proteína espicular (S) es una proteína trimérica transmembrana de tipo I con entre 1.160 y
1.400 aminoácidos, según el tipo de coronavirus. Esta proteína forma la corona de los coronavirus; Está compuesto por tres péptidos repetidos y está altamente glicosilado, lo que facilita su unión a proteínas y azúcares. Cada péptido está formado por dos dominios llamados S1 y S2. En los coronavirus beta como el SARS-CoV-2, la escisión de las subunidades S1 y S2 ocurre durante la fusión entre las membranas.
El dominio S1 tiene a su vez dos subdominios, uno N-terminal (NTD), que termina con un aminoácido que tiene un grupo amino libre (-NH2), y otro C-terminal (CTD), que termina con un grupo carboxilo (-COOH); ambos se unen al receptor ACE2 de la célula huésped, entonces son dominios de unión al receptor (RBD). El dominio S2 es de tipo C-terminal y está altamente conservado entre todos los coronavirus, que difieren mucho más en la subunidad S1. El dominio S2 contiene dos regiones, HR1 y HR2, en las que se repiten grupos de siete aminoácidos (denominados heptidos), en forma abcdefg, que contienen a y d residuos hidrófobos que participan en la fusión entre las membranas. Los dominios HR1 y HR2 son dianas terapéuticas, ya que se conocen fármacos que inhiben su acción, previniendo o dificultando la fusión.
La infección de las células epiteliales de las vías respiratorias está orquestada por la proteína S del virus. En los pasos generales del proceso de fusión primero, el dominio S1 reconoce y se une al receptor de la célula huésped. En segundo lugar, hay una primera escisión de los dominios S1 y S2, y una segunda escisión en el punto S2 '; el último permite que se active el péptido de fusión (FP) que conecta las membranas del huésped y el virus (esta fase se denomina etapa intermedia de fusión o etapa intermedia de fusión). Y tercero, la región entre HR1 y HR2 se remodela (pliega) dando lugar a un heptámero (6-HB) que une ambas membranas permitiendo la entrada del virus. La proteína S de los coronavirus es clave en el desarrollo de vacunas (antígenos que inducen una respuesta inmune a la presencia del dominio S1) y para el desarrollo de antivirales (inhibidores de algunas de las etapas de fusión entre membranas, normalmente atacando regiones específicas del dominio S2). Conocer la estructura tridimensional de la proteína S es fundamental para combatir la epidemia de COVID-19.
La secuencia de la proteína S del SARS-CoV-2 coincide en un 98% con la proteína S del coronavirus Bat-RaTG13, con la gran diferencia que posee cuatro aminoácidos RRAR (arginina- arginina-alanina-arginina) en lugar de una sola arginina ( R). Además, se diferencian en 29 residuos, 17 de los cuales están en la región RBD. La comparación realizada entre los 61 genomas completos de SARS-CoV-2 disponibles en GISAID (Iniciativa global para compartir todos los datos de influenza) muestra que solo hay 9 aminoácidos diferentes entre todos ellos; y todas estas variantes se encuentran en lugares muy bien conservados, lo que no parece afectar la letalidad del coronavirus.
Primero, fue posible caracterizar la estructura 3D de la glicoproteína S espicular del coronavirus SARS-CoV-2 y su dominio de unión al receptor RBD. Luego el del receptor de la célula huésped, la enzima convertidora de angiotensina humana hACE2. El siguiente paso para los investigadores fue determinar la estructura del complejo SARS-CoV-2 RBD / hACE2, que fueron obtenidos por cristalografía de rayos X, alcanzando resoluciones de 2,45 Å y 2,68 Å. Entre los hallazgos, se determinó que cambios estructurales muy sutiles explican la mayor infectividad y patogénesis del SARS-CoV-2 (COVID-19) en comparación con el SARS-CoV (SARS);
Estos hallazgos son de gran relevancia para el desarrollo de fármacos para combatir el COVID-
19. Se han realizado reconstrucciones in silico (mediante modelos teóricos utilizando computadoras), pero la observación de la estructura cristalográfica real mediante difracción de rayos X es fundamental. Como se señaló al principio, los autores están en el proceso de publicar el estudio in silico con sede en Japón que realizaron sobre el mecanismo de acción del dióxido de cloro en el spike de SARS-CoV-2 y la hemoglobina.
El primer problema que surge en el proceso de investigación es cómo formar el complejo SARS- CoV-2 RBD / hACE2 con suficiente estabilidad para su observación; La experiencia previa en la formación del complejo SARS-CoV RBD / hACE2 (que se evidenció en 2005) ha sido clave, en la que se utiliza un puente salino entre Arg426 de RBD y Glu329 de hACE2 para reforzar la unión del complejo. Una observación muy importante es que la cisteina en posiciones Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 y Cys391-Cys525 estabilizan las cinco hojas beta (β1, β2, β3, β4 y β7), y Cys480-
Cys488 es clave en la unión entre la cresta del SARS-CoV-2 RBM y la hélice N-terminal de hACE2 (46), (47), (48).
Cuando se coloca la simulación de la acción del dióxido sobre estos aminoácidos ( Cys ), es fácil entender el fabuloso efecto virucida directo del dióxido en los virus y en particular sobre el SARS- CoV-2.
La imagen que se revela es de un efecto desvastador del dioxido sobre el virus, degradandolo y denaturalizandolo.
La comparación entre los complejos SARS-CoV RBD / hACE2 y SARS-CoV-2 RBD / hACE2 proporciona una idea de por qué COVID-19 es más infeccioso que el SARS-CoV.
El SARS-CoV-2 RBM forma una interfaz de unión más grande y más contactada con hACE2 que SARS-CoV RBM; El puente salino entre el SARS-CoV RBD y el hACE2 es más débil que entre el SARS-CoV-2 RBD y el hACE2. La estructura cristalina del complejo también contiene glucanos acoplados a los cuatro sitios hACE2 y al sitio RBD. El glucano acoplado a Asn90 de hACE2 forma un enlace de hidrógeno con Arg408 en el núcleo de RBD; esta interacción se conserva entre el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV.
Las diferencias estructurales entre los RBM de SARS-CoV-2 y SARSCoV son sutiles, pero afectan las conformaciones de los bucles en las crestas de unión al receptor . En ambos RBM, uno de los enlaces de cresta contiene un enlace disulfuro que es fundamental para la unión. El SARS- CoV y bat-CoV Rs3367 contienen un motivo con tres residuos de Pro-Pro-Ala en dicho bucle; pero en SARS-CoV-2 y bat-CoV RaTG13 muestran un motivo de cuatro residuos Gly-Val / Gln- Glu / Thr-Gly; por tanto, la conformación del bucle cambia gracias a que las glicinas son más flexibles. Este cambio favorece la unión RBD / hACE2. Además, la cresta tiene una conformación más compacta gracias a los enlaces de hidrógeno Asn487 y Ala475 en SARS-CoV-2 RBM, acercando el bucle que contiene Ala475 a hACE2.
El contacto de la cresta de SARS-CoV-2 RBM con la hélice N-terminal de hACE2 es mayor que para SARS-CoV RBM. Por ejemplo, el residuo N-terminal Ser19 de hACE2 forma un nuevo enlace de hidrógeno con la columna vertebral Ala475 de SARS-CoV-2 RBM, y el Gln24 de la hélice N-terminal de hACE2 también forma un nuevo contacto con SARS-CoV-2 RBM. Cuando se compara con Leu472 de SARS-CoV RBM, Phe486 de SARS-CoV-2 RBM apunta en una dirección diferente y forma una región hidrófoba que involucra a Met82, Leu79 y Tyr83 de hACE2.
La comparación con SARS-CoV RBM muestra que estos pequeños cambios estructurales de SARS-CoV-2 RBM son más favorables para la unión de hACE2. Son diferencias sutiles, pero muy relevantes desde el punto de vista funcional. Se han revelado dos puntos críticos de unión (puntos calientes de unión a virus), el punto crítico del hotspot-31 en el puente salino Lys31 y Glu35, y el hotspot-353 en otro puente salino entre Lys353 y Asp38. Estos dos puentes salinos son débiles, debido a la gran distancia en la interacción, pero al estar encerrados en un ambiente hidrofóbico, que reduce la constante dieléctrica efectiva, su energía de enlace es mayor.
Fig. 2 Estructura tridimensional del SARS-CoV-2 Mpro en dos vistas diferentes.
Linlin Zhang et al. Science 2020;368:409-412
Copyright © 2020 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works.
Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC).
Para confirmar estas conclusiones estructurales, se han realizado estudios bioquímicos de la afinidad de la unión de RBD / hACE2 después de introducir ciertas mutaciones en el SARS-CoV- 2 RBD. Estas mutaciones sugieren que el coronavirus del murciélago RaTG13 podría infectar a los humanos ( respaldando el origen zoonótico de la epidemia). Además, los RBM de SARS- CoV-2 y bat-COV RaTG13 contienen un motivo similar de cuatro residuos en la cresta de unión a ACE2, lo que respalda que uno ha evolucionado del otro. Además, para mejorar el reconocimiento de hACE2, SARS-CoV-2 exhibe dos cambios en los residuos L486F e Y493Q de RaTG13, que parecen haber facilitado la transmisión de SARS-CoV-2 de murciélago a humanos. Por lo tanto, puede que no haya un huésped intermedio entre el murciélago y el humano en COVID-19, a diferencia de lo que sucedió con el SARS y el MERS. Por supuesto, por ahora es imposible descartar la existencia de un mediador, que bien podría ser un pangolín u otro animal salvaje vendido en el mercado de Wuhan; En el caso del pangolín, es necesario secuenciar más genomas del coronavirus del pangolín para aclarar el tema, pero hasta ahora se ha evidenciado una similitud genómica de más del 99% entre ellos. (49)
Resultados y conclusiones:
La espiga del SAR-CoV-2 está fuertemente glicosilada y se cree que la glicosilación juega un papel importante en la detección del virus contra nuestro propio sistema inmunológico. Una sección de hélices alfa se extiende a lo largo de la proteína del spike. En su mayor parte, las hojas beta se concentran en este extremo, que es donde la proteína del spike se fusiona con una célula para infectarla.Lo interesante es que las helices estan conformados por aminoacidos sensibles a la acción del dioxido de cloro ( a nivel de la Cisteina).
La proteína de espiga está compuesta en realidad por tres cadenas entrelazadas que tienen secuencias idénticas de aminoácidos, cada una de estas cadenas se llama protomero. Sin embargo, los protomeros no tienen conformaciones tridimensionales idénticas.
Podemos ver la diferencia de conformación en los protómeros examinando una sección de la proteína de punta que es crítica para el ciclo de vida del virus, el dominio de unión al receptor o RBD. El RBD es donde el virus se une a una enzima en la superficie de las células huésped, permitiéndole fusionarse con la célula y transportar el material genético viral en su interior. Dos de estos RBDs están en una conformación más baja en la estructura. Sin embargo, uno de estos RBD se voltea hacia arriba. Esta conformación "hacia arriba" es de mayor energía, lista para unirse al receptor celular y dar lugar a la fusión. Se cree que cuando la proteína de punta se une, cada uno de estos RBD se cambia a esta conformación menos estable.
Nuestras propias enzimas, las que rompen los enlaces peptídicos llamadas proteasas, pueden cortar la proteína espiga en sitios específicos y los cambios de conformación en la fusión de la proteína espiga ocurren. El RBD está unido a la ACE2, que es el receptor en la superficie de nuestra célula al que el coronavirus se une para causar la fusión. Estas estructuras también están fuertemente glicosiladas. Si ocultamos los azúcares para crear un modelo para entender la interaccion RBD-ACE2, y colocar alli al dioxido de cloro actuando sobre los aminoácidos , podemos enfocarnos en algunas de las débiles interacciones que mantienen a la RBD y a la ACE2 juntas.
Por ejemplo, tenemos una extensa red de enlaces de hidrógeno en la interfaz RBD- ACE2 que invade dos residuos de tirosina ( Tyr-489 y Tyr-83 ). Esta cadena lateral de tirosina también está enlazada con el hidrógeno del carbonilo de la cadena lateral de asparagina (Asn-487), que a su vez se enlaza a través de su átomo de hidrógeno N-H al carbonilo de la glutamina en el ACE2 (gln-24). El dioxido de cloro postulamos, oxida estos residuos Tyr-489 y Tyr-83, entre otros , con lo cual la interfase RBD-ACE2 se denaturaliza y el virus o ya no puede unirse o ya lo unido se oxida. Adicionalmente, el dioxido también oxida la prolina presente en el ACE2 lo cual completa la oxidación y deformación del ACE2.
Moviéndose a lo largo de la hélice alfa del ACE2, tenemos la cadena lateral de glutamato que se desprotona a un pH de 7,4, y un residuo de lisina que lleva una carga positiva a ese pH.
Si el virus se fusiona, se libera material genético viral en la célula. En el caso de los coronavirus, este pedazo de ARN viaja a los ribosomas de nuestra célula y lo secuestra para crear sus propias proteínas virales. Una cosa interesante es que este ARN viral es capaz de cambiar el marco de tres letras de las bases del ARN que es leído por el ribosoma; esto esencialmente duplica la secuencia peptídica que se puede hacer de una replica viral usando nuestros ribosomas las proteínas que el virus necesita para ensamblar copias adicionales de sí mismo, que eventualmente serán liberadas de la célula e infectarán a otros. Hay una importante proteína que se traslada en este proceso, y es la principal proteasa que corta la cadena de polipéptidos virales en las proteínas funcionales necesarias para ensamblar nuevos virus. Este es otro objetivo terapéutico, si un individuo ya está infectado con el virus, dado a que se puede administrar una droga que se une a la proteasa y evita que cree proteínas virales maduras, por lo que la replicación viral puede ser frenada.
Esta proteasa principal del SAR-CoV-2 es un dímero formado por dos cadenas de proteínas idénticas, y debe dimerizar para convertirse en una proteasa funcional. Hay muchas interacciones de aminoácidos en la interfaz del dímero, pero los investigadores que publicaron esta estructura cristalina sugieren que las interacciones iónicas entre la cadena lateral de este residuo de arginina
y este glutamato impulsan la dimerización. Esta interacción está presente en ambos lados del dímero. Moviéndose hacia el sitio activo, los residuos importantes son constituidos por cadena de cisteína (Cys-145) y de histidina (His-41).
Esta enzima es una proteasa de cisteína, por lo que utiliza la cisteína nucleófila para atacar el enlace amida de un péptido. En el mecanismo, el nitrógeno de histidina agarra el protón de la cadena lateral de la cisteína permitiéndole atacar el enlace péptidico.
El enlace peptídico se rompe, y entonces una molécula de agua puede entrar, liberando cisteína para que la proteasa pueda romper otra cadena polipeptídica. Las enzimas que contienen residuos catalíticos nucleófilos son excelentes objetivos para la inhibición irreversible. Debido a que contienen una cadena lateral de aminoácidos nucleófilos - cisteína en este caso - se pueden diseñar inhibidores que se unen a la enzima con un enlace covalente permanente. Aqui actúa tambien el dioxido de cloro oxidando la cisteina por lo que este mecanismo es bloqueado por el mismo. A diferencia de los inhibidores reversibles que pueden entrar y salir de un sitio activo, estos inhibidores irreversibles -también llamados inhibidores del suicidio- inactivan permanentemente la proteína, impidiendo que haga su trabajo y creando más proteínas virales. Estos investigadores habían diseñado previamente inhibidores para otras proteasas de coronavirus. Fueron capaces de unir a uno de estos inhibidores al sitio activo de la proteasa SARS-CoV-2. La serina está claramente involucrada en un enlace covalente con la cetona del inhibidor. Ahora, esta es una reacción reversible, así que no es un inhibidor suicida en sí mismo, con presencia de la cisteína atada en un enlace covalente en este sitio activo. Por aquí, este carbonilo del inhibidor está haciendo enlaces de hidrógeno con tres grupos de NH de la proteína. La histidina catalítica de la proteasa también está involucrada en un enlace de hidrógeno. Este anillo está involucrado en una extensa red de enlace de hidrógeno que involucra tanto a los átomos de la columna vertebral de la estrutura como a las cadenas laterales. Conocer los contactos que un inhibidor hace con una enzima permite a los químicos y biólogos considerar las interacciones y potencialmente diseñar inhibidores aún mejores. Mas alla de la inhibición enzimática, la cual sería una estrategia eficaz para controlar el virus, la aparicion del dioxido de cloro como sustancia no que inhibe sino que
“disuelve” por oxidación las estructuras claves del virus, permite una acción con precisión casi que ”quirurgica” molecular, siendo por tanto mucho mas eficaz como mecanismo de control de la infección viral.
En conclusión , el conocer la disposicion de los sitios en los que están ubicados los aminoacidos sensibles a la oxidación por el dioxido de cloro, remarcando que la proteina del spike del coronavirus SARS-CoV-2 contiene 54 tyrosine, 12 tryptophan, 40 residuos de cysteine, ademas de prolina , la cual a su vez está presente el la estructura del ACE2 en conexión con el RBD, pemite proyectar las acciones del dioxido sobre el spike viral. El mejor ejemplo pedagogico es que el spike es la llave y el ACE2 la cerradura. La deformación de la llave por oxidación del dioxido en los aminoacidos cisteina,tirosina, triptofano y prolina , de las cadenas de helices y de la oxidacion de la cerradura (ACE2) impiden no solo la union, sino que disuelven la union ya existente entre spike (RBD ) y ACE, de manera muy rapida, lo que parece explicar la rapidez de la acción clínica del uso del dioxido de cloro en pacientes con COVID19.
Reconocimiento:
Queremos expresar nuestros agradecimientos por su colaboracion y aportes al doctor
Mitchell B. Liester, MD (3)
University of Colorado School of Medicine Colorado Springs Branch
Monument, CO 80132
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488-0024 (office) (719) 338-5719 (cel)
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