Erradicación de MRSA utilizando dióxido de cloro
Las infecciones resistentes a los antimicrobianos (RAM) se cobran actualmente al menos 50.000 vidas cada año en Europa y los EE. UU. Solamente, y muchos cientos de miles más mueren en otras áreas del mundo. En 15 países europeos, más del 10% de las infecciones por Staphylococcus aureus del torrente sanguíneo son causadas por cepas resistentes a la meticilina (MRSA),
y varios de estos países registran tasas de resistencia cercanas al 50%. 1 Además, mientras que el número de infecciones resistentes a los antibióticos está aumentando, el número de nuevos antibióticos está disminuyendo. 1,2 Por lo tanto, es imperativo que se busquen tratamientos nuevos y novedosos para los RAM, y esta es la premisa de esta investigación: usar sustancias naturales para erradicar el MRSA, que no crean más resistencia. El dióxido de cloro utilizado in vitro, ha sido nuestro principal enfoque de esta investigación, ya que fue el más efectivo, en comparación con otras sustancias naturales probadas.
Palabras clave: cepas resistentes a los antimicrobianos, resistentes a la meticilina, Staphylococcus aureu,
síndrome de choque tóxico, eritromicina, dióxido de cloro
Abreviaturas: MRSA, estafilococo aureus resistente a la meticilina; AMR. resistente a los antimicrobianos; TSST-1, síndrome de choque tóxico toxina – 1; ClO 2, dióxido de cloro, PVL, leucocidina de Panton-Valentine; MSSA, saphylococcus aureus sensible a la meticilina
Introducción
Con frecuencia, las infecciones nosocomiales adquiridas en hospitales o UCI son causadas por bacterias resistentes a los antibióticos como el Staphylococcus Aureus resistente a la meticilina (MRSA). Esta resistencia a los antibióticos se acompaña de altas tasas de morbilidad, mortalidad y el alto costo de las instalaciones de salud.
¿Qué es MRSA?
Staphylococcus aureus es un coco grampositivo que es tanto catalasa como coagulasa +. Staphylococcus aureus ha evolucionado para desarrollar numerosas estrategias de evasión inmunitaria para combatir la muerte mediada por neutrófilos, como la activación de neutrófilos, la migración al sitio de infección, la opsonización bacteriana, la fagocitosis y la posterior destrucción mediada por neutrófilos. Se conocen hasta 40 moléculas de evasión inmunitaria de S. aureus y se están identificando nuevas funciones para estas proteínas de evasión.
Producen una variedad de toxinas, que incluyen alfa-toxina, beta-toxina, gamma-toxina, delta-toxina, exfoliatina, enterotoxinas, leucocidina de Panton-Valentine (PVL) y toxina 1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1); las enterotoxinas y TSST-1 se asocian con el síndrome de choque tóxico; La leucoencefalopatía multifocal progresiva se asocia con infecciones necróticas de la piel y los pulmones y es un factor de virulencia importante para la neumonía y la osteomielitis. 3
S. aureus expresa una amplia gama de factores de virulencia, que incluyen
toxinas (hemolisinas y leucocidinas), factores de superficie inmunoevasivos (por ejemplo, cápsula y proteína A) y enzimas que promueven la invasión tisular (por ejemplo, hialuronidasa). 3
La colonización por MRSA aumenta el riesgo de infección y las cepas infectantes coinciden con las cepas colonizadoras hasta en un 50 a 80% de los casos. 4,5
Casi cualquier elemento en contacto con la piel puede servir como un fómite en la transmisión de MRSA, desde abrigos y corbatas blancas hasta bolígrafos y teléfonos móviles.
La colonización puede persistir durante períodos prolongados. El SARM también puede persistir en el entorno del hogar, lo que complica los intentos de erradicación. 6
Al mismo tiempo, la colonización no es estática, ya que se ha descubierto que las cepas evolucionan e incluso se reemplazan dentro del mismo hospedador. 7
Resistencia a las drogas
MRSA ha adquirido MGE que portan genes de resistencia a antibióticos en múltiples ocasiones independientes. La resistencia a penicilina (blaZ), trimetoprima (dfrA y dfrK), eritromicina (ermC), clindamicina (ermC expresada constitutivamente) y tetraciclinas (tetK y tetL) se han identificado en secuencias de inserción, transposones y, a veces, plásmidos tanto en MRSA como en meticilina. Staphylococcus aureus susceptible (MSSA). 8 Probablemente reflejando las fuertes presiones selectivas dentro del entorno hospitalario, la resistencia a los antibióticos a menudo está relacionada genéticamente con la resistencia a desinfectantes o metales pesados (por ejemplo, compuestos de amoníaco cuaternario, mercurio o cadmio) entre las cepas HA-MRSA. 9
¿Qué es el dióxido de cloro?
El compuesto dióxido de cloro (ClO 2), ahora comercialmente importante, no es un descubrimiento reciente. El gas fue producido por primera vez por Humphrey Davy en 1811 al reaccionar ácido clorhídrico con clorato de potasio. Esto produjo "euchlorine", como se denominó entonces. Watt y Burgess, quienes inventaron el blanqueo de pulpa alcalina en 1834, mencionaron el eucloro como agente blanqueador en su primera patente. 10,11
El dióxido de cloro luego se hizo conocido como lejía y más tarde un desinfectante. La producción de ClO 2 del clorato mineral es complicado, sin embargo, y el gas es explosivo por lo que no podría
ser fácilmente utilizado prácticamente hasta la producción de polvo de clorito de sodio por Olin Corporation en 1940.
El dióxido de cloro ahora podría liberarse cuando sea necesario de la sal de clorito. En los suministros de agua municipales, esto generalmente se hace agregando cloro a la solución de clorito y en el laboratorio agregando un ácido a la solución de clorito. Alliger mostró en 1978, 10,11 ese
ClO 2 podría ser aplicado tópicamente por el usuario individual.
ClO 2 es una molécula pequeña con un peso molecular de 67,46 y forma un radical estable. 12 ClO 2 es un oxidante, que se reduce a ion clorito (ClO 2 -) capturando un electrón (ClO 2 + e- → ClO 2 -). El potencial redox (Eº) es relativamente alto como 0,95 V, por lo que no dañar el microbioma humano. 13,14
Solución de dióxido de cloro (ClO2)
El dióxido de cloro es: bactericida, viricida, esporicida, cisticida, algicida y fungicida. 15 Se ha informado que el dióxido de cloro, un oxidante fuerte, puede inhibir o destruir microorganismos en concentraciones que varían de 1 a 100 ppm que producen una potente actividad antiviral, inactivando> o = 99,9% de los virus con un tratamiento de sensibilización de 15 segundos.
15-19
Además, ClO 2 puede eliminar las biopelículas rápidamente 20 porque es altamente soluble en agua y, a diferencia del ozono, no reacciona con el
polisacáridos extracelulares del biofilm. De esta manera ClO 2 Puede penetrar las biopelículas rápidamente para alcanzar y matar los microbios que viven dentro la película: una gran ventaja que es diferente de abordar tanto para Natural
y Medicina alopática. Hay muchos informes de que ClO 2 La solución tiene una actividad virucida. 21-25 La concentración de inactivación contra
varios virus es de 1-2 ppm en poliovirus. 21,22 2,19 ppm en el coronavirus que causa el SRAS. 23 7.5ppm en el virus de la hepatitis A, 24 y 0,2 ppm en rotavirus. 25
Seguridad del dióxido de cloro
Muchas evaluaciones han mostrado ClO 2 compuestos no tóxicos. Cinco décadas de uso no han indicado ningún efecto adverso sobre la salud.
Las principales áreas de uso han sido la desinfección de suministros de agua, la eliminación de sabores y olores no deseados y el blanqueo en las industrias de pulpa y papel y textil.
Las pruebas de toxicología incluyen la ingestión de ClO 2 en agua potable, adiciones al cultivo de tejidos, inyecciones en la sangre, semillas
desinfección, 26,27 desinfección de huevos de insectos, inyecciones debajo de la piel de los animales y en el cerebro de los ratones, quemaduras administradas a más de 1500 ratas e inyecciones en los tallos de las plantas. Las pruebas estándar incluyen mutación de Ames, hámster chino, ojo de conejo, abrasión cutánea, farmacodinámica y teratología. 28
En un estudio, voluntarios humanos bebieron ClO 2 o ClO 2 ¯ en solución hasta 24 ppm y no mostró efectos adversos. 28
Varios estudios examinaron los efectos sobre la toxicidad reproductiva o la teratología. No hay evidencia de malformación fetal o nacimiento.
defectos en ClO 2 concentraciones, tanto en la bebida como en la vía cutánea, hasta 100 ppm. 29-31
Con la alimentación prolongada, la toxicidad se produce principalmente en los glóbulos rojos. Las ratas alimentadas con 1000 mg / l de forma crónica durante 6 meses no mostraron cambios hematológicos significativos. Sin embargo, después de 9 meses, los recuentos de glóbulos rojos, el hematocrito y la hemoglobina disminuyeron en todos los grupos de tratamiento.
Falta de toxicidad a largo plazo, pero la base de bajo nivel se ilustra dramáticamente en dos estudios separados en los que las ratas 32 y abejas 33 fueron alimentados con ClO2 en dosis altas durante dos años. No se observaron efectos nocivos con hasta 100 ppm agregadas al suministro de agua.
Materiales y métodos
En este estudio de investigación se utilizó Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), cultivado en placas de agar con sangre, que fueron proporcionadas por un laboratorio clínico local con certificación.
Cultivo de MRSA
En un gabinete de Clase de Seguridad 2, de las placas de agar sangre (Agar Columbian), se tomó una muestra de MRSA de cultivos aislados utilizando un asa esterilizada y se colocó en tubos estériles con 5 ml de Caldo Tríptico de Soja (TSB). Estos tubos de cultivo se incubaron a 37 grados centígrados durante 48 horas. Estos tubos de cultivo podrían almacenarse en el frigorífico a 4 grados centígrados hasta por 10 días, nuevo por lo que se harían muestras.
Contando bacterias
Uno de los métodos más comunes para cuantificar las bacterias es contar las unidades formadoras de colonias (UFC). Este método ampliamente utilizado es simple, da una buena idea general de la viabilidad celular y es sensible incluso a bajas concentraciones de bacterias.
Una gran desventaja es que se necesitan días para obtener resultados que, en el mejor de los casos, son estimaciones. Una colonia puede surgir de una o mil células y la preparación de la muestra puede variar de una tecnología a otra, así como cada vez, dependiendo de las condiciones de la muestra. En aras de una mayor precisión, en esta investigación, se utilizó el contador de células microbianas QUANTOMTx de Logos Biosystems (logosbio.com). Es un contador celular automatizado basado en imágenes que puede identificar y contar células bacterianas individuales en minutos.
El QUANTOM Tx se enfoca, captura y analiza automáticamente múltiples imágenes de células teñidas con fluorescencia para detectar células bacterianas con alta sensibilidad y precisión. Contiene un algoritmo sofisticado de detección y eliminación de células que puede identificar con precisión células bacterianas individuales incluso en los grupos más reducidos. En estos experimentos, utilizamos el kit de tinción de células viables para detectar células vivas o viables.
Se ha comparado el contador de células microbianas Quantom y se ha comprobado que es tan preciso como las mediciones de citometría de flujo y hemocitómetro, pero reduce en gran medida el tiempo, ya que cada recuento no tarda más de 30 segundos y puede distinguir entre grupos. Las células teñidas se mezclan con el tampón de carga de células QUANTOM I, se cargan en portaobjetos de recuento de células QUANTOM M50 y se centrifugan en la centrífuga QUANTOM para inmovilizar y distribuir uniformemente las células a lo largo de un único plano focal para garantizar una detección celular precisa. Los resultados del recuento y las imágenes se pueden ver y guardar inmediatamente después del recuento.
Para preparar la muestra para el Quantom, se tomaron 10 microlitros (ul) del medio de cultivo utilizando una pipeta electrónica DLAB previamente calibrada y colocada en un tubo Eppendorf esterilizado de 1,5ml. A esto se le añadieron 2 ul de colorante de tinción celular viable y se incubó en una incubadora Heraeus a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A esta muestra se le añadió 8 ul de tampón para mejorar la señal de fluorescencia. Para ahorrar en los portaobjetos consumibles de Quantom, reciclamos los portaobjetos lavándolos en los sistemas limpiadores de portaobjetos iWash® de Imrali Inventions (www.imraliinventions.com).
A estos tubos, ¿se agregó dióxido de cloro en diferentes concentraciones, por diferentes duraciones? La concentración de dióxido de cloro varió de 0,5 μl (0,5 ppm) a 5 μl (5 ppm), y la duración de la exposición a la muestra varió de 30 minutos a 30 segundos.
Para cada experimento basado en tiempo y duración, se prepararon dos tubos de la muestra para mantener constante el factor de dilución. Según la cantidad de dióxido de cloro añadida al tubo experimental, se añadió la misma cantidad de agua al tubo de control.
De estos tubos de control y experimentales, se tomaron 6 μl de la muestra usando una pipeta electrónica y se colocaron en los portaobjetos de recuento de células M50. Los portaobjetos se colocaron en la centrífuga QUANTOM durante 8 minutos a 300 RCF (fuerza centrífuga relativa) y luego se colocaron en el contador de células microbianas Quantom para tomar una medida de referencia (control) y otra medida del tubo experimental.
La configuración óptima del Contador de células microbianas Quantom para el protocolo MRSA que encontramos durante la prueba se estableció en Factor de dilución 2, Tamaño mínimo del objeto de fluorescencia 0.4um, Tamaño máximo del objeto fluorescente 15μm Redondez 50%, Nivel de desagrupación 7 y Sensibilidad de detección 7.
Preparación de dióxido de cloro
El dióxido de cloro tradicional, llamado MMS, se preparó como unaEl dióxido de cloro tradicional, llamado MMS, se preparó como unasolución usando dos componentes, solución de clorito de sodio (solución al25% en agua) y solución de ácido clorhídrico al 4%. Se colocó una gota decada una de estas soluciones en un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml y sedejó que se activara durante 30 segundos. Además, se realizaron másexperimentos utilizando una nueva generación de dióxido de cloro llamadaCDSplus, un producto patentado fabricado por Aquarius Pro-Life comoproducto de tratamiento de agua. Esta es una forma tamponada de dióxidode cloro a un pH estándar de 7 y una concentración de 3000 ppm cuando seactiva (250 ml). Del CDSplus activado (250 ml), se extrajeron 83 μl = 1 ppm;166 μl = 2 ppm; 0,25 ml = 3 ppm.
Protocolos experimentales
Varias concentraciones de dióxido de cloro
Se utilizaron MMS y CDSplus. El rango fue de 1 ppm a 5 ppm. El tiempo deSe utilizaron MMS y CDSplus. El rango fue de 1 ppm a 5 ppm. El tiempo deexposición al dióxido de cloro osciló entre 30 minutos y 30 segundos. En losexperimentos iniciales no estaba claro qué tiempo se requeriría para lainhibición, pero se demostró rápidamente que era menos de un minuto deexposición. La mayoría de los experimentos, por lo tanto, tuvieron untiempo de exposición de 1 minuto.
Resultados Experimentos iniciales
Comenzamos a tomar diferentes concentraciones de dióxido de clorobasadas en el MMS tradicional y probamos estas concentraciones con MRSA ensolución durante diferentes tiempos que van desde 30 minutos a 30 segundos. 1μl de dióxido de cloro equivale a una concentración de 1 ppm. La concentración más baja de dióxido de cloro utilizada para erradicar completamente el MRSA enestos experimentos fue de 0,5 ppm, con un tiempo de exposición de 30segundos.
La tabla 1 a continuación muestra las diferentes concentraciones enfunción del tiempo, con la concentración de células de MRSA medida por elcontador de células Quantom.Como se puede ver, para todas las concentracionesde dióxido de cloro que van de 1 a 5 ppm, y el tiempo de exposición de 30minutos a 30 segundos, la inhibición del crecimiento de MRSA fue del 99,99% a lo largo de todos estos experimentos.
Tabla 1 Comparación de recuentos bacterianos antes y después de la exposición al dióxido de cloro.
Experimento 1
La Tabla 2 muestra los números de recuento de células para las 6 concentraciones de dióxido de cloro utilizadas, a saber: se utilizaron 0,5, 1, 2, 3, 4 y 5 ppm y se midió un recuento de línea de base para cada concentración. El experimento número 0 es el recuento de línea de base (control) para cada grupo de experimento que utiliza diferentes concentraciones de dióxido de cloro. Para cada concentración, el experimento se repitió 5 veces, con concentraciones medias dadas.
De los experimentos iniciales, dado que El dióxido de cloro fue encontrado para eliminar el 99,99% de las bacterias MRSA en concentraciones de 5 ppm por solo 30 segundos, todos los demás experimentos usaron un tiempo de exposición de un minuto como estándar, mientras probaban diferentes concentraciones.
En este experimento, las concentraciones de ClO2 que van desde 0,5
- Se tomaron 5ppm, utilizando el MMS Tradicional. En cada una de las 5 concentraciones, la tasa de inhibición fue del 100%; consulte la Tabla 2 y la Figura
- La Figura 1 muestra la repetibilidad del recuento de bacterias MRSA utilizando diferentes concentraciones que van de 1 a 5 ppm. Se tomó un recuento de línea de base para cada concentración; esto se repitió 5 veces. En las 5 repeticiones, la inhibición del crecimiento de MRSA fue del 100%.
La Figura 2 compara el recuento de células de MRSA con la concentración de MMS durante 1 minuto. El área cubierta es igual al número de recuento de celdas. Los recuentos iniciales para cada concentración se muestran en el lado izquierdo del gráfico y el final se muestra en el lado derecho del gráfico. La tasa de inhibición fue del 100% para todas las concentraciones de dióxido de cloro, con un tiempo de exposición de 1 minuto.
Figura 1 Dióxido de cloro a diferentes concentraciones usando MMS
Figura 2 Diferentes concentraciones de MMS tradicional para una duración de 1 min.
Tabla 2 Dioxido de cloro (MMS tradicional) a diferentes concentracionesrepetido 5 veces
La Tabla 3 compara las concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 ppm para unaLa Tabla 3 compara las concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 ppm para una exposición de 1 minuto al dióxido de cloro. El control se comparó con el experimental para las diferentes concentraciones. Para todas estas concentraciones de dióxido de cloro, la tasa de inhibición fue del 100%.
Experimento 2: uso de CDSplus
Se repitió el mismo experimento anterior usando la generación CDS plus, usando concentraciones de 1-3 ppm. En cada una de las 3 concentraciones, la tasa de inhibición fue nuevamente del 100%; consulte la tabla 4 y el gráfico 3.La Figura 3 muestra la erradicación de células MRSA utilizando diferentesconcentraciones de CDSplus, a saber, 1, 2 y 3 ppm. Se midió un recuento de línea de base para el grupo de control, y luego se agregó cada concentración de CDS plus y se repitió dos veces.
Para todas las concentraciones, la tasa de inhibición fue del 100%.
La Tabla 4 compara las concentraciones de 1, 2 y 3 ppmpara una exposición de 60 segundos al dióxido de cloro, utilizando el CDS plus de nueva generación.
El control se comparó con el experimental para las diferentes concentraciones.
figura 3 MRSA-CDSPlus con diferentes concentraciones.
La Figura 4 compara el recuento de células MRSA con la concentración de dióxido de cloro (CDS plus) durante 1 minuto. La línea superior muestra el recuento de células de referencia para el grupo de control. La línea inferior muestra los recuentos de células MRSA después de la exposición de las células durante 1 minuto a diferentes concentraciones de dióxido de cloro; la tasa de inhibición fue del 100%.
Figura 4 Diferente concentración de CDSPlus durante 60 segundos.
Cuadro 4 Dióxido de cloro (CDSplus) a diferentes concentraciones para una exposición de 1Cuadro 4 Dióxido de cloro (CDSplus) a diferentes concentraciones para una exposición de 1minuto
Conclusiones
MRSA es versátil e impredecible. Su capacidad de adaptación genética yMRSA es versátil e impredecible. Su capacidad de adaptación genética yla aparición en serie de cepas epidémicas exitosas hacen que siga siendouna gran amenaza para la salud humana.
La mortalidad persistentemente alta asociada con la infección invasiva por MRSA, a pesar de que la FDA ha aprobado múltiples antibióticos con efectividad contra MRSA desde 2014, destaca la necesidad de ensayos de alta calidad para determinar el manejo óptimo para estos pacientes. En estos experimentos in vitro, la eficacia del dióxido de cloro contra MRSA se ha demostrado de manera consistente, con inhibición del crecimiento de 99,99% -100% incluso en las concentraciones más pequeñas de 0,5 ppm.
Dada la seguridad probada del dióxido de cloro en experimentos con animales y humanos hasta la fecha, existe una necesidad urgente de ensayos clínicos de alta calidad para determinar la eficacia del dióxido de cloro en individuos infectados con MRSA en la actualidad.
Dichos estudios recaerán en la comunidad clínica para realizarlos, comenzando con ensayos clínicos individuales en diferentes países del mundo, con la creación de una red de ensayos clínicos para recopilar todos los datos y desarrollar protocolos clínicos seguros y efectivos. Con respecto a la seguridad, en un experimento cuidadosamente diseñado, se encontró que el tiempo característico necesario para matar un microbio es solo de unos pocos milisegundos. Como ClO 2 es un compuesto bastante volátil su tiempo de contacto (su permanencia en la superficie tratada) se limita a unos minutos.
Si bien esta estadía es lo suficientemente segura (siendo al menos 3 órdenes de magnitud más larga que el tiempo de muerte) para inactivar todas las bacterias en
la superficie del organismo, es demasiado corta para ClO 2 penetrar más profundamente que unas pocas décimas de milímetro; por lo tanto, no puede causar ningún daño real a un organismo que es mucho más grande que una bacteria.
También hay muchos testimonios del uso de dióxido de cloro por voluntarios humanos para la erradicación de muchas enfermedades infecciosas, incluida la malaria y el VIH, pero uno de los pioneros en África,Jim Humble. Existe mucha controversia sobre esta evidencia anecdótica,pero no se puede ignorar el número de testigos que dan testimonio: ¡lapolítica y los intereses personales deben dejarse de lado y la ciencia debe examinar la evidencia para los beneficios de la humanidad! 34,35
Referencias y documento original desde el siguiente enlace:
