Eradikace MRSA pomocí oxidu chloričitého
Antimikrobiální rezistentní infekce (AMR) si v současné době v Evropě a ve Spojených státech každoročně vyžádají nejméně 50.000 15 životů a další stovky tisíc dalších zemřou v jiných oblastech světa. V 10 evropských zemích je více než XNUMX% infekcí Staphylococcus aureus v krevním oběhu způsobeno kmeny rezistentními na meticilin (MRSA),
a několik z těchto zemí registruje míru odporu téměř 50%. 1 Kromě toho, zatímco počet infekcí rezistentních na antibiotika se zvyšuje, počet nových antibiotik klesá. 1,2 Proto je nutné hledat nové a nové způsoby léčby nežádoucích účinků, a to je předpokladem tohoto výzkumu: používat k vymýcení MRSA přírodní látky, které nevytvářejí další rezistenci. Oxid chloričitý používaný in vitro byl naším hlavním zaměřením tohoto výzkumu, protože byl nejúčinnější ve srovnání s jinými testovanými přírodními látkami.
Klíčová slova: kmeny rezistentní na antimikrobiální látky, rezistentní na meticilin, Staphylococcus aureu,
syndrom toxického šoku, erythromycin, oxid chloričitý
Zkratky: MRSA, methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus; AMR. antimikrobiální odolnost; TSST-1, syndrom toxického šoku toxin-1; ClO 2, oxid chloričitý, PVL, Panton-Valentine Leukocidin; MSSA, methicilin-senzitivní saphylococcus aureus
Úvod
Nozokomiální infekce získané v nemocnicích nebo na JIP jsou často způsobeny bakteriemi rezistentními na antibiotika, jako je například Staphylococcus Aureus (MRSA) rezistentní na meticilin. Tato odolnost vůči antibiotikům je doprovázena vysokou mírou nemocnosti, úmrtnosti a vysokými náklady na zdravotnická zařízení.
Co je MRSA?
Staphylococcus aureus je grampozitivní kokos, který je katalázou i koagulázou +. Staphylococcus aureus se vyvinul tak, aby vyvinul řadu strategií vyhýbání se imunitě v boji proti smrti zprostředkované neutrofily, včetně aktivace neutrofilů, migrace na místo infekce, bakteriální opsonizace, fagocytóza a následná destrukce zprostředkovaná neutrofily. Je známo až 40 molekul vyhýbajících se imunitnímu systému S. aureus a jsou identifikovány nové funkce pro tyto vyhýbající se proteiny.
Produkují různé toxiny, včetně alfa-toxinu, beta-toxinu, gama-toxinu, delta-toxinu, exfoliatinu, enterotoxinů, leukocidinu Panton-Valentine (PVL) a toxinu 1 syndromu toxického šoku (TSST-1); enterotoxiny a TSST-1 jsou spojeny se syndromem toxického šoku; Progresivní multifokální leukoencefalopatie je spojena s nekrotickými infekcemi kůže a plic a je důležitým faktorem virulence pro zápal plic a osteomyelitidu. 3
S. aureus vyjadřuje širokou škálu faktorů virulence, včetně
toxiny (hemolysiny a leukocidiny), imunoevazivní povrchové faktory (např. kapsle a protein A) a enzymy, které podporují invazi do tkáně (např. hyaluronidáza). 3
Kolonizace MRSA zvyšuje riziko infekce a infekční kmeny se shodují s kolonizačními kmeny až v 50–80% případů. 4,5
Téměř cokoli, co je v kontaktu s pokožkou, může sloužit jako podnět při přenosu MRSA, od kabátů a bílých kravat po pera a mobilní telefony.
Kolonizace může přetrvávat po dlouhou dobu. MRSA může také přetrvávat v domácím prostředí, což komplikuje pokusy o eradikaci. 6
Kolonizace přitom není statická, protože bylo zjištěno, že kmeny se vyvíjejí a dokonce nahrazují v rámci stejného hostitele. 7
Odolnost vůči lékům
MRSA získala MGE nesoucí geny rezistence na antibiotika při několika nezávislých příležitostech. Rezistence na penicilin (blaZ), trimethoprim (dfrA a dfrK), erythromycin (ermC), klindamycin (konstitučně exprimované ermC) a tetracykliny (tetK a tetL) byly identifikovány v inzertních sekvencích, transpozonech a někdy i plazmidech v obou MRSA jako v methicilin. Citlivý Staphylococcus aureus (MSSA). 8 Pravděpodobně odráží silné selektivní tlaky v nemocničním prostředí, odolnost vůči antibiotikům je často geneticky spojena s odolností vůči dezinfekčním prostředkům nebo těžkým kovům (např. Kvartérní sloučeniny amoniaku, rtuť nebo kadmium) mezi kmeny HA-MRSA. 9
Co je oxid chloričitý?
Nyní komerčně důležitá sloučenina oxid chloričitý (ClO 2) není nedávným objevem. Plyn poprvé vyrobil Humphrey Davy v roce 1811 reakcí kyseliny chlorovodíkové s chlorečnanem draselným. Tak vznikl „euchlorin“, jak se tomu tehdy říkalo. Watt a Burgess, kteří v roce 1834 vynalezli zásadité bělení buničiny, ve svém prvním patentu zmínili euchlorin jako bělicí činidlo. 10,11
Oxid chloričitý se později stal známým jako bělidlo a později jako dezinfekční prostředek. Výroba ClO 2 z minerálního chlorečnanu je však složitá a plyn je výbušný, takže nemohl
lze snadno použít prakticky až do výroby prášku chloritanu sodného společností Olin Corporation v roce 1940.
Oxid chloričitý se nyní mohl v případě potřeby z chloritové soli uvolňovat. V obecních dodávkách vody se to obvykle provádí přidáním chloru do roztoku chloritanu a v laboratoři přidáním kyseliny do roztoku chloritanu. Alliger ukázal v roce 1978, 10,11
ClO 2 by mohl být topicky aplikován jednotlivým uživatelem.
ClO 2 je malá molekula s molekulovou hmotností 67,46 a tvoří stabilní radikál. 12 ClO 2 je oxidační činidlo, které se redukuje na chloritový iont (ClO 2 -) zachycením elektronu (ClO 2 + e- → ClO 2 -). Redoxní potenciál (Eº) je relativně vysoký až 0,95 V, takže nepoškozuje lidský mikrobiom. 13,14
Roztok oxidu chloričitého (ClO2)
Oxid chloričitý je: baktericidní, virucidní, sporicidní, cysticidní, algaecidní a fungicidní. Bylo publikováno, že oxid chloričitý, silné oxidační činidlo, inhibuje nebo ničí mikroorganismy v koncentracích v rozmezí od 15 do 1 ppm, které produkují silnou antivirovou aktivitu, inaktivující> nebo = 100% virů ošetřením 99,9sekundové senzibilizace.
15-19
Kromě toho může ClO 2 rychle odstraňovat biofilmy 20, protože je vysoce rozpustný ve vodě a na rozdíl od ozonu nereaguje s
extracelulární polysacharidy z biofilmu. Tímto způsobem může ClO 2 rychle pronikat biofilmy, aby dosáhl a zabil mikroby, kteří žijí ve filmu: velká výhoda, která se liší od řešení pro přírodní
a alopatická medicína. Existuje mnoho zpráv, že roztok ClO 2 má virucidní aktivitu. 21-25 Koncentrace inaktivace proti
různých virů je 1–2 ppm v polioviru. 21,22 2,19 ppm v koronaviru, který způsobuje SARS. 23 7.5 ppm u viru hepatitidy A, 24 a 0,2 ppm u rotaviru. 25
Bezpečnost oxidu chloričitého
Mnoho hodnocení ukázalo netoxické sloučeniny ClO 2. Pět desetiletí používání nenaznačilo žádné nepříznivé účinky na zdraví.
Hlavními oblastmi použití byla dezinfekce dodávek vody, odstranění nežádoucích chutí a pachů a bělení v celulózovém a papírenském a textilním průmyslu.
Toxikologické testy zahrnují požití ClO 2 v pitné vodě, přísady do tkáňové kultury, injekce do krve, semena
dezinfekce, 26,27 dezinfekce vajíček hmyzu, injekce pod kůži zvířat a do mozku myší, popáleniny podané více než 1500 potkanům a injekce do stonků rostlin. Standardní testy zahrnují Amesovu mutaci, křečka čínského, králičí oko, oděrku kůže, farmakodynamiku a teratologii. 28
V jedné studii lidští dobrovolníci pili ClO 2 nebo ClO 2 v roztoku až do 24 ppm a nevykazovaly žádné nežádoucí účinky. 28
Několik studií zkoumalo účinky na reprodukční toxicitu nebo teratologii. Neexistují žádné důkazy o malformaci plodu nebo narození.
defekty v koncentracích ClO 2, jak v nápoji, tak v pokožce, až 100 ppm. 29-31
Při dlouhodobém krmení dochází k toxicitě hlavně u červených krvinek. Krysy krmené chronicky 1000 mg / l po dobu 6 měsíců nevykazovaly významné hematologické změny. Po 9 měsících se však počet červených krvinek, hematokrit a hemoglobin snížily ve všech léčebných skupinách.
Nedostatek dlouhodobé toxicity, ale základní úroveň na nízké úrovni je dramaticky znázorněna ve dvou oddělených studiích, ve kterých bylo 32 potkanů a 33 včel krmeno vysokými dávkami ClO2 po dobu dvou let. Nebyly pozorovány žádné škodlivé účinky, pokud bylo do vodovodu přidáno až 100 ppm.
Materiály a metody
V této výzkumné studii byl použit methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA), pěstovaný na krevních agarových plotnách, které byly poskytnuty místní certifikovanou klinickou laboratoří.
Kultura MRSA
Ve skříni bezpečnostní třídy 2 byl z misek krevního agaru (Columbian Agar) odebrán vzorek MRSA z izolovaných kultur pomocí sterilizované kličky a umístěn do sterilních zkumavek s 5 ml tryptického sójového bujónu (TSB). Tyto kultivační zkumavky byly inkubovány při 37 stupních Celsia po dobu 48 hodin. Tyto kultivační zkumavky mohly být skladovány v chladničce při 4 stupních Celsia po dobu až 10 dnů, pro které by byly opět vyrobeny vzorky.
Počítání bakterií
Jednou z nejběžnějších metod kvantifikace bakterií je počítání jednotek tvořících kolonie (CFU). Tato široce používaná metoda je jednoduchá, dává dobrou obecnou představu o životaschopnosti buněk a je citlivá i na nízké koncentrace bakterií.
Jednou velkou nevýhodou je, že dosažení výsledků, které jsou přinejlepším odhady, trvá několik dní. Kolonie může vzniknout z jedné nebo tisíce buněk a příprava vzorku se může lišit od technologie k technologii, stejně jako pokaždé, v závislosti na podmínkách vzorku. V zájmu přesnosti byl při tomto vyšetřování použit počítač mikrobiálních buněk QUANTOMTx od společnosti Logos Biosystems (logosbio.com). Jedná se o automatizovaný počítačový čítač buněk, který dokáže identifikovat a spočítat jednotlivé bakteriální buňky během několika minut.
QUANTOM Tx automaticky zaostří, zachytí a analyzuje více snímků buněk obarvených fluorescencí, aby detekoval bakteriální buňky s vysokou citlivostí a přesností. Obsahuje propracovaný algoritmus detekce a odstraňování buněk, který dokáže přesně identifikovat jednotlivé bakteriální buňky i v těch nejmenších skupinách. V těchto experimentech používáme sadu pro barvení životaschopných buněk k detekci živých nebo životaschopných buněk.
Mikrobiální čítač buněk Quantom byl porovnán a bylo zjištěno, že je stejně přesný jako měření průtokovou cytometrií a hemocytometrem, ale výrazně zkracuje čas, protože každý počet netrvá déle než 30 sekund a dokáže rozlišovat mezi skupinami. Obarvené buňky se smíchají s pufrem pro načítání buněk QUANTOM I, nanesou se na sklíčka pro počítání buněk QUANTOM M50 a odstředí se v odstředivce QUANTOM pro imobilizaci a rovnoměrnou distribuci buněk podél jediné ohniskové roviny, aby byla zajištěna konzistentní přesná detekce buněk. Výsledky počítání a obrázky lze zobrazit a uložit ihned po počítání.
K přípravě vzorku pro Quantom bylo odebráno 10 mikrolitrů (ul) kultivačního média pomocí dříve kalibrované elektronické pipety DLAB a umístěno do sterilní 1,5 ml zkumavky Eppendorf. K tomu byly přidány 2 ul životaschopného barviva pro barvení buněk a inkubováno v inkubátoru Heraeus při 37 stupních Celsia po dobu 30 minut. K tomuto vzorku bylo přidáno 8 ul pufru pro zesílení fluorescenčního signálu. Abychom ušetřili na spotřebních sklíčkách Quantom, recyklujeme podložní sklíčka jejich praním v Imrali Inventions iWash® Slide Cleaning Systems (www.imraliinventions.com).
Byl do těchto zkumavek přidán oxid chloričitý v různých koncentracích, po různě dlouhou dobu? Koncentrace oxidu chloričitého se pohybovala od 0,5 µl (0,5 ppm) do 5 µl (5 ppm) a doba expozice vzorku se pohybovala od 30 minut do 30 sekund.
Pro každý experiment na základě času a trvání byly připraveny dvě zkumavky se vzorkem, aby byl faktor ředění konstantní. V závislosti na množství oxidu chloričitého přidaného do experimentální zkumavky bylo do kontrolní zkumavky přidáno stejné množství vody.
Z těchto kontrolních a experimentálních zkumavek bylo pomocí elektronické pipety odebráno 6 µl vzorku a umístěno na sklíčka pro počítání buněk M50. Sklíčka byla umístěna do centrifugy QUANTOM na 8 minut při 300 RCF (relativní odstředivá síla) a poté umístěny do čítače mikrobiálních buněk Quantom, aby se provedlo referenční měření (kontrola) a další měření z experimentální zkumavky.
Optimální konfigurace čítače mikrobiálních buněk Quantom pro protokol MRSA, který jsme našli během testu, byla stanovena v ředicím faktoru 2, minimální velikost fluorescenčního objektu 0.4um, maximální velikost fluorescenčního objektu 15μm, kulatost 50%, úroveň declusteru 7 a citlivost detekce 7.
Příprava oxidu chloričitého
Tradiční oxid chloričitý, nazývaný MMS, byl připraven jako tradiční oxid chloričitý, nazývaný MMS, byl připraven jako roztok za použití dvou složek, roztoku chloritanu sodného (25% roztok ve vodě) a 4% roztoku kyseliny chlorovodíkové. Jedna kapka z každého z těchto roztoků byla umístěna do sterilní 1,5 ml zkumavky Eppendorf a ponechána aktivovat po dobu 30 sekund. Kromě toho bylo provedeno více experimentů s použitím nové generace oxidu chloričitého nazývaného CDSplus, patentovaný produkt vyráběný společností Aquarius Pro-Life jako přípravek na úpravu vody. Toto je pufrovaná forma oxidu chloričitého o standardním pH 7 a koncentraci 3000 ppm, když je aktivní (250 ml). Z aktivovaného CDSplus (250 ml) bylo extrahováno 83 ul = 1 ppm, 166 ul = 2 ppm; 0,25 ml = 3 ppm.
Experimentální protokoly
Různé koncentrace oxidu chloričitého
Byly použity MMS a CDSplus. Rozsah byl 1 ppm až 5 ppm. Byl použit čas MMS a CDSplus. Rozsah byl 1 ppm až 5 ppm. Doba expozice oxidu chloričitému se pohybovala od 30 minut do 30 sekund. V počátečních experimentech nebylo jasné, jaký čas bude vyžadován pro inhibici, ale rychle se ukázalo, že je kratší než minuta expozice. Většina experimentů proto měla expoziční čas 1 minutu.
Výsledky Počáteční experimenty
Začali jsme brát různé koncentrace chlorbased dioxidu v tradičních MMS a testovali jsme tyto koncentrace s MRSA v roztoku po různě dlouhou dobu od 30 minut do 30 sekund. 1 μl oxidu chloričitého odpovídá koncentraci 1 ppm. Nejnižší koncentrace oxidu chloričitého použitá k úplné eradikaci MRSA v těchto experimentech byla 0,5 ppm s dobou expozice 30 sekund.
Tabulka 1 níže ukazuje různé koncentrace jako funkci času, přičemž koncentrace buněk MRSA se měří pomocí čítače buněk Quantom. Jak vidíte, pro všechny koncentrace oxidu chloričitého v rozmezí od 1 do 5 ppm a dobu expozice od 30 minut do 30 sekund byla inhibice růstu MRSA během všech těchto experimentů 99,99%.
Tabulka 1 Srovnání počtu bakterií před a po expozici oxidu chloričitému.
Experiment 1
Tabulka 2 ukazuje počty buněk pro 6 použitých koncentrací oxidu chloričitého, konkrétně: bylo použito 0,5, 1, 2, 3, 4 a 5 ppm a pro každou koncentraci byl změřen základní počet. Experiment číslo 0 je základní (kontrolní) počet pro každou experimentální skupinu používající různé koncentrace oxidu chloričitého. Pro každou koncentraci byl experiment opakován 5krát, přičemž byly uvedeny průměrné koncentrace.
Od počátečních experimentů, protože bylo zjištěno, že oxid chloričitý zabíjí 99,99% bakterií MRSA v koncentracích 5 ppm po dobu pouhých 30 sekund, všechny ostatní experimenty používaly jako standard dobu expozice jednu minutu, zatímco zkoušely různé koncentrace.
V tomto experimentu se koncentrace ClO2 pohybovaly od 0,5
- Bylo odebráno 5 str./min pomocí tradiční MMS. Při každé z 5 koncentrací byla míra inhibice 100%; viz tabulka 2 a obrázek
- Obrázek 1 ukazuje opakovatelnost počtu bakterií MRSA s použitím různých koncentrací v rozmezí od 1 do 5 ppm. Pro každou koncentraci byl proveden základní počet; toto se opakovalo 5krát. Ve všech 5 replikátech byla inhibice růstu MRSA 100%.
Obrázek 2 porovnává počet buněk MRSA s koncentrací MMS během 1 minuty. Pokrytá oblast se rovná počtu buněk. Počáteční počty pro každou koncentraci jsou zobrazeny na levé straně grafu a konečné počty jsou zobrazeny na pravé straně grafu. Rychlost inhibice byla 100% pro všechny koncentrace oxidu chloričitého s dobou expozice 1 minuta.
Obrázek 1 Oxid chloričitý v různých koncentracích pomocí MMS
Obrázek 2 Různé koncentrace tradičních MMS po dobu 1 minuty.
Tabulka 2 Oxid chloričitý (tradiční MMS) v různých koncentracích se opakuje 5krát
Tabulka 3 porovnává koncentrace 1, 2, 3, 4 a 5 ppm pro tabulku 3 porovnává koncentrace 1, 2, 3, 4 a 5 ppm po dobu 1 minuty expozice oxidu chloričitému. Kontrola byla pro různé koncentrace porovnána s experimentální. Pro všechny tyto koncentrace oxidu chloričitého byla míra inhibice 100%.
Experiment 2: pomocí CDSplus
Stejný experiment jako výše byl opakován s použitím generace CDS plus s použitím koncentrací 1-3 ppm. Při každé ze 3 koncentrací byla míra inhibice opět 100%; viz tabulka 4 a obrázek 3. Obrázek 3 ukazuje eradikaci buněk MRSA pomocí různých koncentrací CDSplus, konkrétně 1, 2 a 3 ppm. U kontrolní skupiny byl změřen základní počet a poté byla přidána každá koncentrace CDS plus a dvakrát opakována.
Pro všechny koncentrace byla míra inhibice 100%.
Tabulka 4 porovnává koncentrace 1, 2 a 3 pp po dobu 60 sekund vystavení oxidu chloričitému s použitím nové generace CDS plus.
Kontrola byla pro různé koncentrace porovnána s experimentální.
Obrázek 3 MRSA-CDSPlus s různými koncentracemi.
Obrázek 4 porovnává počet buněk MRSA s koncentrací oxidu chloričitého (CDS plus) po dobu 1 minuty. Horní řádek zobrazuje počet referenčních buněk pro kontrolní skupinu. Dolní řádek ukazuje počet buněk MRSA po vystavení buněk po dobu 1 minuty různým koncentracím oxidu chloričitého; míra inhibice byla 100%.
Obrázek 4 Různá koncentrace CDSPlus po dobu 60 sekund.
Tabulka 4 Oxid chloričitý (CDSplus) v různých koncentracích po dobu 1 minuty expozice Tabulka 4 Oxid chloričitý (CDSplus) v různých koncentracích po dobu 1 minuty
Závěry
MRSA je univerzální a nepředvídatelný. Jejich genetická přizpůsobivost a MRSA jsou univerzální a nepředvídatelné. Jeho genetická přizpůsobivost a sériový vzhled úspěšných kmenů epidemií znamenají, že zůstává hlavní hrozbou pro lidské zdraví.
Trvale vysoká úmrtnost spojená s invazivní infekcí MRSA, navzdory skutečnosti, že FDA schválila od roku 2014 více antibiotik účinných proti MRSA, zdůrazňuje potřebu vysoce kvalitních studií k určení optimálního managementu pro tyto pacienty. V těchto experimentech in vitro byla konzistentně prokázána účinnost oxidu chloričitého proti MRSA, s inhibicí růstu 99,99% -100% i při nejmenších koncentracích 0,5 ppm.
Vzhledem k dosavadní prokázané bezpečnosti oxidu chloričitého v pokusech na zvířatech a lidech existuje naléhavá potřeba vysoce kvalitních klinických studií, které by dnes určovaly účinnost oxidu chloričitého u jedinců infikovaných MRSA.
Tyto studie bude provádět klinická komunita, počínaje jednotlivými klinickými studiemi v různých zemích světa, vytvořením sítě klinických studií za účelem shromažďování všech údajů a vývoje bezpečných a efektivních klinických protokolů. Pokud jde o bezpečnost, v pečlivě navrženém experimentu byla charakteristická doba potřebná k zabití mikroba pouze několik milisekund. Protože ClO 2 je poměrně těkavá sloučenina, je její doba kontaktu (její trvanlivost na ošetřeném povrchu) omezena na několik minut.
I když je tento pobyt dostatečně bezpečný (je alespoň o 3 řády delší než doba smrti), aby deaktivoval všechny bakterie v
povrch těla je příliš krátký na to, aby ClO 2 pronikl hlouběji než několik desetin milimetru; proto nemůže způsobit žádnou skutečnou újmu organismu, který je mnohem větší než bakterie.
Existuje také mnoho svědectví o používání oxidu chloričitého lidskými dobrovolníky k vymýcení mnoha infekčních chorob, včetně malárie a HIV, ale jeden z průkopníků v Africe Jim Humble. O těchto neoficiálních důkazech se vede mnoho polemik, ale počet svědků, kteří vypovídají, nelze ignorovat: politika a osobní zájmy musí být zrušeny a věda musí důkazy zkoumat ve prospěch lidstva! 34,35
Reference a původní dokument z následujícího odkazu:
