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Éradication du SARM à l'aide de dioxyde de chlore

mrsaLes infections résistantes aux antimicrobiens (RAM) font actuellement au moins 50.000 15 morts chaque année en Europe et aux États-Unis seulement, et plusieurs centaines de milliers d'autres meurent dans d'autres régions du monde. Dans 10 pays européens, plus de XNUMX % des infections à Staphylococcus aureus dans le sang sont causées par des souches résistantes à la méthicilline (SARM),

et plusieurs de ces pays enregistrent des taux de résistance proches de 50 %. 1 De plus, alors que le nombre d'infections résistantes aux antibiotiques augmente, le nombre de nouveaux antibiotiques diminue. 1,2 Par conséquent, il est impératif que de nouveaux traitements soient recherchés pour les effets indésirables, et c'est la prémisse de cette recherche : utiliser des substances naturelles pour éradiquer le SARM, qui ne créent pas de résistance supplémentaire. Le dioxyde de chlore utilisé in vitro, a été notre principal objectif de cette recherche, car il était le plus efficace, par rapport aux autres substances naturelles testées.

Mots clés : souches résistantes aux antimicrobiens, résistantes à la méthicilline, Staphylococcus aureu,

syndrome de choc toxique, érythromycine, dioxyde de chlore

 

Abréviations : SARM, Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline ; AMR. résistant aux antimicrobiens; TSST-1, syndrome de choc toxique toxine-1 ; ClO 2, dioxyde de chlore, PVL, leucocidine Panton-Valentine; MSSA, saphylococcus aureus sensible à la méthicilline

 

Introduction

Les infections nosocomiales contractées dans les hôpitaux ou les unités de soins intensifs sont souvent causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques telles que le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM). Cette résistance aux antibiotiques s'accompagne de taux élevés de morbidité, de mortalité et du coût élevé des formations sanitaires.

¿Qué es SARM?

Staphylococcus aureus est une noix de coco à Gram positif qui est à la fois catalase et coagulase +. Staphylococcus aureus a évolué pour développer de nombreuses stratégies d'évitement immunitaire pour lutter contre la mort induite par les neutrophiles, y compris l'activation des neutrophiles, la migration vers le site d'infection, l'opsonisation bactérienne, la phagocytose et la destruction ultérieure induite par les neutrophiles. Jusqu'à 40 molécules d'évasion immunitaire de S. aureus sont connues et de nouvelles fonctions sont identifiées pour ces protéines d'évasion.

Ils produisent une variété de toxines, y compris l'alpha-toxine, la bêta-toxine, la gamma-toxine, la delta-toxine, l'exfoliatine, les entérotoxines, la leucocidine de Panton-Valentine (PVL) et la toxine du syndrome de choc toxique 1 (TSST-1); les entérotoxines et le TSST-1 sont associés au syndrome de choc toxique; La leucoencéphalopathie multifocale progressive est associée à des infections nécrotiques de la peau et des poumons et est un facteur de virulence important pour la pneumonie et l'ostéomyélite. 3

S. aureus exprime un large éventail de facteurs de virulence, notamment

les toxines (hémolysines et leucocidines), les facteurs de surface immunoévasifs (par exemple, capsule et protéine A) et les enzymes qui favorisent l'invasion des tissus (par exemple, hyaluronidase). 3

La colonisation par le SARM augmente le risque d'infection et les souches infectieuses coïncident avec les souches colonisatrices dans jusqu'à 50 à 80 % des cas. 4,5

Presque tout ce qui entre en contact avec la peau peut servir de vecteur de transmission du SARM, des manteaux et cravates blanches aux stylos et téléphones portables.

La colonisation peut persister pendant de longues périodes. Le SARM peut également persister dans l'environnement familial, ce qui complique les tentatives d'éradication. 6

Dans le même temps, la colonisation n'est pas statique, car il a été constaté que des souches évoluent et même se remplacent au sein du même hôte. 7

 

La résistance aux médicaments

Le SARM a acquis du MGE porteur de gènes de résistance aux antibiotiques à de multiples occasions indépendantes. La résistance à la pénicilline (blaZ), au triméthoprime (dfrA et dfrK), à l'érythromycine (ermC), à la clindamycine (ermC exprimé de manière constitutive) et aux tétracyclines (tetK et tetL) a été identifiée dans les séquences d'insertion, les transposons et parfois les plasmides dans le SARM comme dans méthicilline. Staphylococcus aureus sensible (SASM). 8 Reflétant probablement les fortes pressions sélectives en milieu hospitalier, la résistance aux antibiotiques est souvent génétiquement liée à la résistance aux désinfectants ou aux métaux lourds (par exemple, les composés d'ammoniac quaternaire, le mercure ou le cadmium) parmi les souches HA-MRSA. 9

Qu'est-ce que le dioxyde de chlore ?

Le dioxyde de chlore (ClO 2 ) composé désormais commercialement important n'est pas une découverte récente. Le gaz a été produit pour la première fois par Humphrey Davy en 1811 en faisant réagir de l'acide chlorhydrique avec du chlorate de potassium. Cela produisait de l'"euchlore", comme on l'appelait alors. Watt et Burgess, qui ont inventé le blanchiment de la pâte alcaline en 1834, ont mentionné l'euchlore comme agent de blanchiment dans leur premier brevet. 10,11

Le dioxyde de chlore est devenu plus tard connu sous le nom d'eau de Javel et plus tard un désinfectant. La production de ClO 2 à partir du chlorate minéral est cependant compliquée et le gaz est explosif, il ne peut donc pas

être facilement utilisé pratiquement jusqu'à la production de poudre de chlorite de sodium par Olin Corporation en 1940.

Le dioxyde de chlore pouvait désormais être libéré en cas de besoin à partir du sel de chlorite. Dans les approvisionnements en eau municipaux, cela se fait généralement en ajoutant du chlore à la solution de chlorite et en laboratoire en ajoutant un acide à la solution de chlorite. Alliger a montré en 1978, 10,11 que
Le ClO 2 peut être appliqué localement par l'utilisateur individuel.

 

ClO 2 est une petite molécule d'un poids moléculaire de 67,46 et forme un radical stable. 12 ClO 2 est un oxydant, qui est réduit en ion chlorite (ClO 2 -) en capturant un électron (ClO 2 + e- → ClO 2 -). Le potentiel redox (Eº) est relativement élevé à 0,95 V, il ne nuit donc pas au microbiome humain. 13,14

 

Solution de dioxyde de chlore (ClO2)

Le dioxyde de chlore est : bactéricide, virucide, sporicide, cysticide, algicide et fongicide. 15 Il a été rapporté que le dioxyde de chlore, un oxydant puissant, inhibe ou détruit les micro-organismes à des concentrations allant de 1 à 100 ppm qui produisent une puissante activité antivirale, inactivant > ou = 99,9 % des virus avec un traitement de sensibilisation de 15 secondes.
15-19

De plus, le ClO 2 peut éliminer rapidement les biofilms 20 car il est très soluble dans l'eau et, contrairement à l'ozone, ne réagit pas avec
polysaccharides extracellulaires du biofilm. De cette façon, le ClO 2 peut pénétrer rapidement dans les biofilms pour atteindre et tuer les microbes qui vivent à l'intérieur du film : un grand avantage qui est différent d'aborder à la fois pour Natural
et médecine allopathique. Il existe de nombreux rapports indiquant que la solution de ClO 2 a une activité virucide. 21-25 La concentration d'inactivation contre

divers virus est de 1 à 2 ppm dans le poliovirus. 21,22 2,19 ppm dans le coronavirus qui cause le SRAS. 23 7.5 ppm dans le virus de l'hépatite A, 24 et 0,2 ppm dans le rotavirus. 25

Sécurité du dioxyde de chlore

De nombreuses évaluations ont montré des composés ClO 2 non toxiques. Cinq décennies d'utilisation n'ont indiqué aucun effet indésirable sur la santé.

Les principaux domaines d'utilisation ont été la désinfection des approvisionnements en eau, l'élimination des goûts et des odeurs indésirables et le blanchiment dans les industries de la pâte et du papier et du textile.

Les tests toxicologiques incluent l'ingestion de ClO 2 dans l'eau potable, les ajouts à la culture tissulaire, les injections dans le sang, les graines
désinfection, 26,27 désinfection d'œufs d'insectes, injections sous la peau d'animaux et dans le cerveau de souris, brûlures administrées à plus de 1500 rats, et injections dans des tiges de plantes. Les tests standard incluent la mutation Ames, le hamster chinois, l'œil de lapin, l'abrasion cutanée, la pharmacodynamie et la tératologie. 28

Dans une étude, des volontaires humains ont bu du ClO 2 ou du ClO 2 ¯ en solution jusqu'à 24 ppm et n'ont montré aucun effet indésirable. 28

Plusieurs études ont examiné les effets sur la toxicité pour la reproduction ou la tératologie. Il n'y a aucune preuve de malformation fœtale ou de naissance.
défauts dans les concentrations de ClO 2 , à la fois dans la boisson et par voie cutanée, jusqu'à 100 ppm. 29-31

Avec une alimentation prolongée, la toxicité se produit principalement dans les globules rouges. Les rats nourris à 1000 mg/l de façon chronique pendant 6 mois n'ont pas montré de changements hématologiques significatifs. Cependant, après 9 mois, le nombre de globules rouges, l'hématocrite et l'hémoglobine ont diminué dans tous les groupes de traitement.

L'absence de toxicité à long terme, mais la ligne de base de faible niveau est illustrée de manière spectaculaire dans deux études distinctes dans lesquelles 32 rats et 33 abeilles ont été nourris à forte dose de ClO2 pendant deux ans. Aucun effet nocif n'a été observé avec jusqu'à 100 ppm ajoutés à l'approvisionnement en eau.

Matériaux et méthodes

Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), cultivé sur des plaques de gélose au sang, fournies par un laboratoire clinique local certifié, a été utilisé dans cette étude de recherche.

Culture SARM

Dans une armoire de classe de sécurité 2, à partir des plaques de gélose au sang (Columbian Agar), un échantillon de SARM a été prélevé sur des cultures isolées à l'aide d'une anse stérilisée et placé dans des tubes stériles avec 5 ml de Tryptic Soy Broth (TSB). Ces tubes de culture ont été incubés à 37 degrés centigrades pendant 48 heures. Ces tubes de culture pourraient être conservés au réfrigérateur à 4 degrés Celsius jusqu'à 10 jours, encore une fois pour lesquels des échantillons seraient prélevés.

Compter les bactéries

L'une des méthodes les plus courantes pour quantifier les bactéries consiste à compter les unités formant colonies (UFC). Cette méthode largement utilisée est simple, donne une bonne idée générale de la viabilité cellulaire, et est sensible même à de faibles concentrations de bactéries.

Un gros inconvénient est qu'il faut des jours pour obtenir des résultats qui sont au mieux des estimations. Une colonie peut provenir d'une ou d'un millier de cellules et la préparation de l'échantillon peut varier d'une technologie à l'autre, ainsi qu'à chaque fois, en fonction des conditions de l'échantillon. Par souci de précision, le compteur de cellules microbiennes QUANTOMTx de Logos Biosystems (logosbio.com) a été utilisé dans cette enquête. Il s'agit d'un compteur de cellules automatisé basé sur des images qui peut identifier et compter les cellules bactériennes individuelles en quelques minutes.

Le QUANTOM Tx se concentre, capture et analyse automatiquement plusieurs images cellulaires colorées par fluorescence pour détecter les cellules bactériennes avec une sensibilité et une précision élevées. Il contient un algorithme sophistiqué de détection et d'élimination des cellules qui peut identifier avec précision les cellules bactériennes individuelles, même dans les plus petits groupes. Dans ces expériences, nous utilisons le Viable Cell Staining Kit pour détecter les cellules vivantes ou viables.

Le compteur de cellules microbiennes Quantom a été comparé et s'est avéré aussi précis que les mesures de cytométrie en flux et d'hémocytomètre, mais réduit considérablement le temps car chaque comptage ne prend pas plus de 30 secondes et peut distinguer les groupes . Les cellules colorées sont mélangées avec le tampon de chargement de cellules QUANTOM I, chargées sur des lames de comptage de cellules QUANTOM M50 et centrifugées dans la centrifugeuse QUANTOM pour immobiliser et répartir uniformément les cellules le long d'un plan focal unique afin d'assurer une détection cellulaire précise et cohérente. Les résultats de comptage et les images peuvent être visualisés et enregistrés immédiatement après le comptage.

Pour préparer l'échantillon pour le Quantom, 10 microlitres (ul) du milieu de culture ont été prélevés à l'aide d'une pipette électronique DLAB préalablement calibrée et placés dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 ml. A cela ont été ajoutés 2 ul de colorant de coloration de cellules viables et incubés dans un incubateur Heraeus à 37 degrés centigrades pendant 30 minutes. 8 ul de tampon ont été ajoutés à cet échantillon pour améliorer le signal de fluorescence. Pour économiser sur les lames consommables Quantom, nous recyclons les lames en les lavant dans les systèmes de nettoyage de lames Imrali Inventions iWash® (www.imraliinventions.com).

A ces tubes, du dioxyde de chlore a-t-il été ajouté à différentes concentrations, pour différentes durées ? La concentration de dioxyde de chlore variait de 0,5 µl (0,5 ppm) à 5 µl (5 ppm) et la durée d'exposition à l'échantillon variait de 30 minutes à 30 secondes.

Pour chaque expérience basée sur le temps et la durée, deux tubes d'échantillon ont été préparés pour maintenir le facteur de dilution constant. Selon la quantité de dioxyde de chlore ajoutée au tube expérimental, la même quantité d'eau a été ajoutée au tube témoin.

A partir de ces tubes témoins et expérimentaux, 6 µl de l'échantillon ont été prélevés à l'aide d'une pipette électronique et placés sur les lames de comptage cellulaire M50. Les lames ont été placées dans la centrifugeuse QUANTOM pendant 8 minutes à 300 RCF (force centrifuge relative) puis placées dans le compteur de cellules microbiennes Quantom pour prendre une mesure de référence (contrôle) et une autre mesure du tube expérimental.

La configuration optimale du compteur de cellules microbiennes Quantom pour le protocole MRSA que nous avons trouvé au cours du test a été établie dans le facteur de dilution 2, la taille minimale de l'objet de fluorescence 0.4 um, la taille maximale de l'objet fluorescent 15 m, l'arrondi 50%, le niveau de dégroupage 7 et la sensibilité de détection 7.

Préparation de dioxyde de chlore

 

Le dioxyde de chlore traditionnel, appelé MMS, a été préparé sous forme de dioxyde de chlore traditionnel, appelé MMS, a été préparé sous forme de solution utilisant deux composants, une solution de chlorite de sodium (solution à 25 % dans l'eau) et une solution d'acide chlorhydrique à 4 %. Une goutte de chacune de ces solutions a été placée dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 ml et laissée s'activer pendant 30 secondes. De plus, d'autres expériences ont été menées en utilisant une nouvelle génération de dioxyde de chlore appelée CDSplus, un produit exclusif fabriqué par Aquarius Pro-Life comme produit de traitement de l'eau. Il s'agit d'une forme tamponnée de dioxyde de chlore à un pH standard de 7 et une concentration de 3000 ppm lorsqu'elle est active (250 ml). Du CDSplus activé (250 ml), 83 pl = 1 ppm, 166 pl = 2 ppm ont été extraits ; 0,25 ml = 3 ppm.

 

Protocoles expérimentaux

Diverses concentrations de dioxyde de chlore

MMS et CDSplus ont été utilisés. La plage était de 1 ppm à 5 ppm. Le temps du MMS et du CDSplus ont été utilisés. La plage était de 1 ppm à 5 ppm. Le temps d'exposition au dioxyde de chlore variait de 30 minutes à 30 secondes. Dans les expériences initiales, il n'était pas clair quel temps serait nécessaire pour l'inhibition, mais il s'est rapidement avéré qu'il était inférieur à une minute d'exposition. La plupart des expériences ont donc eu un temps d'exposition de 1 minute.

Résultats Premières expériences

Nous avons commencé à prendre différentes concentrations de dioxyde de chlore dans du MMS traditionnel et avons testé ces concentrations avec du SARM en solution pendant différentes durées allant de 30 minutes à 30 secondes. 1μl de dioxyde de chlore équivaut à une concentration de 1 ppm. La plus faible concentration de dioxyde de chlore utilisée pour éradiquer complètement le SARM dans ces expériences était de 0,5 ppm, avec un temps d'exposition de 30 secondes.

Le tableau 1 ci-dessous présente les différentes concentrations en fonction du temps, avec la concentration cellulaire en SARM mesurée par le compteur de cellules Quantom.Comme vous pouvez le voir, pour toutes les concentrations de dioxyde de chlore allant de 1 à 5 ppm, et le temps d'exposition de 30 minutes à 30 secondes, l'inhibition de la croissance de MRSA était de 99,99 % tout au long de ces expériences.

 

Tableau 1 Comparaison des dénombrements bactériens avant et après exposition au dioxyde de chlore.

 

Expérience 1

Le tableau 2 montre les nombres de cellules pour les 6 concentrations de dioxyde de chlore utilisées, à savoir : 0,5, 1, 2, 3, 4 et 5 ppm ont été utilisés et un compte de base a été mesuré pour chaque concentration. L'expérience numéro 0 est le nombre de référence (contrôle) pour chaque groupe d'expérience utilisant différentes concentrations de dioxyde de chlore. Pour chaque concentration, l'expérience a été répétée 5 fois, avec des concentrations moyennes données.

Depuis les expériences initiales, puisque le dioxyde de chlore s'est avéré tuer 99,99% des bactéries SARM à des concentrations de 5 ppm pendant seulement 30 secondes, toutes les autres expériences ont utilisé un temps d'exposition d'une minute comme norme, alors qu'elles ont essayé différentes concentrations.

Dans cette expérience, des concentrations de ClO2 allant de 0,5

  • 5 ppm ont été prises, en utilisant le MMS traditionnel. A chacune des 5 concentrations, le taux d'inhibition était de 100 % ; se référer au tableau 2 et à la figure
  1. La figure 1 montre la répétabilité du nombre de bactéries MRSA en utilisant différentes concentrations allant de 1 à 5 ppm. Un comptage de base a été effectué pour chaque concentration; cela a été répété 5 fois. Dans les 5 réplicats, l'inhibition de la croissance du SARM était de 100 %.

La figure 2 compare le nombre de cellules de SARM à la concentration de MMS sur 1 minute. La surface couverte est égale au nombre de cellules. Les comptes initiaux pour chaque concentration sont affichés sur le côté gauche du graphique et les comptes finaux sont affichés sur le côté droit du graphique. Le taux d'inhibition était de 100 % pour toutes les concentrations de dioxyde de chlore, avec un temps d'exposition de 1 minute.

 

Figure 1 Dioxyde de chlore à différentes concentrations en utilisant le MMS

 

 

Figure 2 Différentes concentrations de MMS traditionnel pour une durée de 1 min.

Tableau 2 Dioxyde de chlore (MMS traditionnel) à différentes concentrations répétées 5 fois

 

 

Le tableau 3 compare les concentrations de 1, 2, 3, 4 et 5 ppm pour un tableau 3 compare les concentrations de 1, 2, 3, 4 et 5 ppm pour une exposition de 1 minute au dioxyde de chlore. Le contrôle a été comparé à l'expérimental pour les différentes concentrations. Pour toutes ces concentrations de dioxyde de chlore, le taux d'inhibition était de 100 %.

 

Expérience 2 : utilisation de CDSplus

La même expérience que ci-dessus a été répétée en utilisant la génération CDS plus, en utilisant des concentrations de 1 à 3 ppm. A chacune des 3 concentrations, le taux d'inhibition était à nouveau de 100 % ; Voir le tableau 4 et la figure 3. La figure 3 montre l'éradication des cellules MRSA en utilisant différentes concentrations de CDSplus, à savoir 1, 2 et 3 ppm. Une numération de base a été mesurée pour le groupe témoin, puis chaque concentration de CDS plus a été ajoutée et répétée deux fois.

Pour toutes les concentrations, le taux d'inhibition était de 100 %.

Le tableau 4 compare les concentrations de 1, 2 et 3 pp pour une exposition de 60 secondes au dioxyde de chlore, en utilisant le CDS plus de nouvelle génération.

Le contrôle a été comparé à l'expérimental pour les différentes concentrations.

 

Figure 3 MRSA-CDSPlus avec différentes concentrations.

 

La figure 4 compare le nombre de cellules MRSA avec la concentration de dioxyde de chlore (CDS plus) pendant 1 minute. La ligne du haut montre le nombre de cellules de référence pour le groupe témoin. La ligne du bas montre le nombre de cellules de SARM après exposition des cellules pendant 1 minute à différentes concentrations de dioxyde de chlore ; le taux d'inhibition était de 100 %.

 

 

Figure 4 Différentes concentrations de CDSPlus pendant 60 secondes.

Tableau 4 Dioxyde de chlore (CDSplus) à différentes concentrations pour une exposition de 1 minute Tableau 4 Dioxyde de chlore (CDSplus) à différentes concentrations pour une exposition de 1 minute

 

Conclusions

Le SARM est polyvalent et imprévisible. Leur adaptabilité génétique et le SARM sont polyvalents et imprévisibles. Son adaptabilité génétique et l'apparition en série de souches épidémiques réussies font qu'il reste une menace majeure pour la santé humaine.

La mortalité élevée persistante associée à l'infection invasive à SARM, malgré le fait que la FDA a approuvé plusieurs antibiotiques efficaces contre le SARM depuis 2014, souligne la nécessité d'essais de haute qualité pour déterminer la prise en charge optimale pour ces patients. Dans ces expériences in vitro, l'efficacité du dioxyde de chlore contre le SARM a été constamment démontrée, avec une inhibition de la croissance de 99,99 % à 100 %, même aux plus faibles concentrations de 0,5 ppm.

Compte tenu de l'innocuité prouvée du dioxyde de chlore dans les expériences sur les animaux et les humains à ce jour, il existe un besoin urgent d'essais cliniques de haute qualité pour déterminer l'efficacité du dioxyde de chlore chez les personnes infectées par le SARM aujourd'hui.

Ces études seront menées par la communauté clinique, à commencer par des essais cliniques individuels dans différents pays du monde, avec la création d'un réseau d'essais cliniques pour collecter toutes les données et développer des protocoles cliniques sûrs et efficaces. En ce qui concerne la sécurité, dans une expérience soigneusement conçue, le temps caractéristique nécessaire pour tuer un microbe s'est avéré n'être que de quelques millisecondes. Le ClO 2 étant un composé assez volatil, son temps de contact (sa permanence sur la surface traitée) est limité à quelques minutes.

Bien que ce séjour soit suffisamment sûr (étant au moins 3 ordres de grandeur plus long que le moment de la mort) pour inactiver toutes les bactéries dans
la surface du corps est trop courte pour que le ClO 2 pénètre à plus de quelques dixièmes de millimètre ; par conséquent, il ne peut causer aucun dommage réel à un organisme beaucoup plus gros qu'une bactérie. 

 

Il existe également de nombreux témoignages de l'utilisation du dioxyde de chlore par des volontaires humains pour l'éradication de nombreuses maladies infectieuses, dont le paludisme et le VIH, mais l'un des pionniers en Afrique, Jim Humble. Il y a beaucoup de controverse sur cette preuve anecdotique, mais le nombre de témoins qui témoignent ne peut être ignoré : la politique et les intérêts personnels doivent être mis de côté et la science doit examiner les preuves pour le bien de l'humanité ! 34,35

 

Références et document original à partir du lien suivant :

 

SARM

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Éradication du SARM à l'aide de dioxyde de chlore

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Éradication du SARM à l'aide de dioxyde de chlore.en.es

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