Eradicazione dell'MRSA mediante biossido di cloro
Le infezioni resistenti agli antimicrobici (AMR) attualmente mietono almeno 50.000 vittime ogni anno solo in Europa e negli Stati Uniti e molte altre centinaia di migliaia muoiono in altre aree del mondo. In 15 paesi europei, oltre il 10% delle infezioni da Staphylococcus aureus nel sangue è causato da ceppi meticillino-resistenti (MRSA),
e molti di questi paesi registrano tassi di resistenza vicini al 50%. 1 Inoltre, mentre aumenta il numero di infezioni resistenti agli antibiotici, diminuisce il numero di nuovi antibiotici. 1,2 Pertanto, è imperativo che si cerchino nuovi e nuovi trattamenti per le ADR, e questa è la premessa di questa ricerca: utilizzare sostanze naturali per eradicare l'MRSA, che non creano ulteriore resistenza. Il biossido di cloro utilizzato in vitro, è stato il nostro obiettivo principale di questa ricerca, poiché era il più efficace, rispetto ad altre sostanze naturali testate.
Parole chiave: ceppi resistenti agli antimicrobici, resistente alla meticillina, Staphylococcus aureu,
sindrome da shock tossico, eritromicina, diossido di cloro
Abbreviazioni: MRSA, Staphylococcus aureus resistente alla meticillina; AMR. resistente agli antimicrobici; TSST-1, sindrome da shock tossico della tossina-1; ClO 2, Biossido di Cloro, PVL, Panton-San Valentino Leucocidina; MSSA, Saphylococcus aureus sensibile alla meticillina
Introduzione
Le infezioni nosocomiali acquisite negli ospedali o nelle unità di terapia intensiva sono spesso causate da batteri resistenti agli antibiotici come lo Staphylococcus Aureus meticillino-resistente (MRSA). Questa resistenza agli antibiotici è accompagnata da alti tassi di morbilità, mortalità e dall'alto costo delle strutture sanitarie.
Qué es MRSA?
Lo Staphylococcus aureus è una noce di cocco gram-positiva che è sia catalasi che coagulasi +. Lo Staphylococcus aureus si è evoluto per sviluppare numerose strategie di prevenzione immunitaria per combattere la morte mediata dai neutrofili, tra cui l'attivazione dei neutrofili, la migrazione al sito di infezione, l'opsonizzazione batterica, la fagocitosi e la successiva distruzione mediata dai neutrofili. Sono note fino a 40 molecole di S. aureus che eludono il sistema immunitario e si stanno identificando nuove funzioni per queste proteine elusive.
Producono una varietà di tossine, tra cui alfa-tossina, beta-tossina, gamma-tossina, delta-tossina, esfoliatina, enterotossine, leucocidina Panton-San Valentino (PVL) e tossina 1 della sindrome da shock tossico (TSST-1); le enterotossine e il TSST-1 sono associati alla sindrome da shock tossico; La leucoencefalopatia multifocale progressiva è associata a infezioni necrotiche della pelle e dei polmoni ed è un importante fattore di virulenza per la polmonite e l'osteomielite. 3
S. aureus esprime un'ampia gamma di fattori di virulenza, tra cui
tossine (emolisine e leucocidine), fattori di superficie immunoevasivi (p. es., capsula e proteina A) ed enzimi che promuovono l'invasione dei tessuti (p. es., ialuronidasi). 3
La colonizzazione da MRSA aumenta il rischio di infezione e i ceppi infettanti coincidono con i ceppi colonizzanti fino al 50-80% dei casi. 4,5
Quasi tutto ciò che viene a contatto con la pelle può fungere da fomite nella trasmissione di MRSA, da cappotti e cravatte bianche a penne e telefoni cellulari.
La colonizzazione può persistere per lunghi periodi. L'MRSA può persistere anche nell'ambiente domestico, complicando i tentativi di eradicazione. 6
Allo stesso tempo, la colonizzazione non è statica, poiché è stato scoperto che i ceppi si evolvono e persino si sostituiscono all'interno dello stesso ospite. 7
Resistenza ai farmaci
MRSA ha acquisito MGE che trasporta geni di resistenza agli antibiotici in più occasioni indipendenti. Resistenza a penicillina (blaZ), trimetoprim (dfrA e dfrK), eritromicina (ermC), clindamicina (ermC costitutivamente espressa) e tetracicline (tetK e tetL) sono state identificate nelle sequenze di inserzione, trasposoni e talvolta plasmidi sia in MRSA come in meticillina. Staphylococcus aureus sensibile (MSSA). 8 Probabilmente riflettendo le forti pressioni selettive all'interno dell'ambiente ospedaliero, la resistenza agli antibiotici è spesso correlata geneticamente alla resistenza ai disinfettanti o ai metalli pesanti (ad es., composti di ammoniaca quaternaria, mercurio o cadmio) tra i ceppi di HA-MRSA. 9
Cos'è il biossido di cloro?
L'ormai importante composto commercialmente biossido di cloro (ClO 2) non è una scoperta recente. Il gas fu prodotto per la prima volta da Humphrey Davy nel 1811 facendo reagire l'acido cloridrico con il clorato di potassio. Questo produceva "eucloro", come si chiamava allora. Watt e Burgess, che inventarono lo sbiancamento della pasta alcalina nel 1834, menzionarono l'eucloro come agente sbiancante nel loro primo brevetto. 10,11
Il biossido di cloro in seguito divenne noto come candeggina e in seguito come disinfettante. Tuttavia, la produzione di ClO 2 dal clorato minerale è complicata e il gas è esplosivo, quindi non può
essere facilmente utilizzato praticamente fino alla produzione di polvere di clorito di sodio da parte della Olin Corporation nel 1940.
Il biossido di cloro potrebbe ora essere rilasciato quando necessario dal sale di clorito. Nelle forniture idriche municipali, questo viene solitamente fatto aggiungendo cloro alla soluzione di clorito e in laboratorio aggiungendo un acido alla soluzione di clorito. Alliger ha mostrato nel 1978, 10,11 che
ClO 2 potrebbe essere applicato localmente dal singolo utente.
ClO 2 è una piccola molecola con un peso molecolare di 67,46 e forma un radicale stabile. 12 ClO 2 è un ossidante, che viene ridotto a ione clorito (ClO 2 -) catturando un elettrone (ClO 2 + e- → ClO 2 -). Il potenziale redox (Eº) è relativamente alto, pari a 0,95 V, quindi non danneggia il microbioma umano. 13,14
Soluzione di biossido di cloro (ClO2)
Il biossido di cloro è: battericida, virucida, sporicida, cisticida, alghicida e fungicida. 15 È stato riportato che il biossido di cloro, un forte ossidante, inibisce o distrugge i microrganismi in concentrazioni comprese tra 1 e 100 ppm che producono una potente attività antivirale, inattivando > o = 99,9% dei virus con un trattamento di sensibilizzazione di 15 secondi.
15-19
Inoltre, ClO 2 può rimuovere rapidamente i biofilm 20 perché è altamente solubile in acqua e, a differenza dell'ozono, non reagisce con
polisaccaridi extracellulari da biofilm. In questo modo ClO 2 può penetrare rapidamente nei biofilm per raggiungere e uccidere i microbi che vivono all'interno del film: un grande vantaggio che è diverso dall'affrontare sia per Natural
e Medicina Allopatica. Ci sono molti rapporti che la soluzione ClO 2 ha attività virucida. 21-25 La concentrazione di inattivazione contro
vari virus è di 1-2 ppm nel poliovirus. 21,22 2,19 ppm nel coronavirus che causa la SARS. 23 7.5 ppm nel virus dell'epatite A, 24 e 0,2 ppm nel rotavirus. 25
Sicurezza del biossido di cloro
Molte valutazioni hanno mostrato composti non tossici di ClO2. Cinque decenni di utilizzo non hanno indicato alcun effetto negativo sulla salute.
Le principali aree di utilizzo sono state la disinfezione delle riserve idriche, la rimozione di sapori e odori indesiderati e lo sbiancamento nelle industrie della cellulosa, della carta e dei tessuti.
I test tossicologici comprendono l'ingestione di ClO 2 nell'acqua potabile, aggiunte a colture di tessuti, iniezioni nel sangue, semi
disinfezione, 26,27 disinfezione di uova di insetti, iniezioni sottocutanee di animali e nel cervello di topi, ustioni somministrate a più di 1500 ratti e iniezioni negli steli delle piante. I test standard includono la mutazione di Ames, il criceto cinese, l'occhio di coniglio, l'abrasione cutanea, la farmacodinamica e la teratologia. 28
In uno studio, volontari umani hanno bevuto ClO 2 o ClO 2 ¯ in soluzione fino a 24 ppm e non hanno mostrato effetti avversi. 28
Diversi studi hanno esaminato gli effetti sulla tossicità riproduttiva o sulla teratologia. Non ci sono prove di malformazione fetale o parto.
difetti nelle concentrazioni di ClO 2, sia nella bevanda che nella via cutanea, fino a 100 ppm. 29-31
Con un'alimentazione prolungata, la tossicità si verifica principalmente nei globuli rossi. I ratti alimentati cronicamente con 1000 mg/l per 6 mesi non hanno mostrato alterazioni ematologiche significative. Tuttavia, dopo 9 mesi, la conta dei globuli rossi, l'ematocrito e l'emoglobina sono diminuiti in tutti i gruppi di trattamento.
La mancanza di tossicità a lungo termine, ma la linea di base di basso livello è drammaticamente illustrata in due studi separati in cui 32 ratti e 33 api sono stati nutriti con ClO2 ad alte dosi per due anni. Non sono stati osservati effetti dannosi con l'aggiunta di fino a 100 ppm alla fornitura d'acqua.
Materiali e metodi
In questo studio di ricerca è stato utilizzato Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA), coltivato su piastre di agar sangue, fornite da un laboratorio clinico certificato locale.
Cultura MRSA
In una cabina di sicurezza di Classe 2, dalle piastre di agar sangue (Columbian Agar), è stato prelevato un campione di MRSA da colture isolate utilizzando un'ansa sterilizzata e posto in provette sterili con 5 ml di Tryptic Soy Broth (TSB). Queste provette di coltura sono state incubate a 37 gradi centigradi per 48 ore. Queste provette di coltura potrebbero essere conservate in frigorifero a 4 gradi Celsius per un massimo di 10 giorni, sempre per i quali sarebbero stati realizzati campioni.
Contare i batteri
Uno dei metodi più comuni per quantificare i batteri è il conteggio delle unità formanti colonie (CFU). Questo metodo ampiamente utilizzato è semplice, dà una buona idea generale della vitalità cellulare ed è sensibile anche a basse concentrazioni di batteri.
Un grosso svantaggio è che ci vogliono giorni per ottenere risultati che sono, nel migliore dei casi, delle stime. Una colonia può nascere da una o mille cellule e la preparazione del campione può variare da tecnologia a tecnologia, nonché ogni volta, a seconda delle condizioni del campione. Per motivi di precisione, in questa indagine è stato utilizzato il contatore di cellule microbiche QUANTOMTx di Logos Biosystems (logosbio.com). È un contatore di cellule automatizzato basato su immagini in grado di identificare e contare le singole cellule batteriche in pochi minuti.
Il QUANTOM Tx mette a fuoco, acquisisce e analizza automaticamente più immagini cellulari colorate con fluorescenza per rilevare le cellule batteriche con elevata sensibilità e precisione. Contiene un sofisticato algoritmo di rilevamento e rimozione delle cellule in grado di identificare con precisione le singole cellule batteriche anche nei gruppi più piccoli. In questi esperimenti, usiamo il Viable Cell Staining Kit per rilevare cellule vive o vitali.
Il contatore di cellule microbiche Quantom è stato confrontato ed è risultato accurato quanto le misurazioni della citometria a flusso e dell'emocitometro, ma riduce notevolmente il tempo poiché ogni conteggio non richiede più di 30 secondi e può distinguere tra i gruppi . Le cellule colorate vengono miscelate con QUANTOM I Cell Loading Buffer, caricate su QUANTOM M50 Cell Counting Slides e centrifugate nella centrifuga QUANTOM per immobilizzare e distribuire uniformemente le cellule lungo un unico piano focale per garantire un rilevamento cellulare preciso e coerente. I risultati del conteggio e le immagini possono essere visualizzati e salvati immediatamente dopo il conteggio.
Per preparare il campione per il Quantom, sono stati prelevati 10 microlitri (ul) del terreno di coltura utilizzando una pipetta elettronica DLAB precedentemente calibrata e posti in una provetta Eppendorf sterile da 1,5 ml. A questo sono stati aggiunti 2 ul di colorante per la colorazione delle cellule vitali e incubati in un incubatore Heraeus a 37 gradi centigradi per 30 minuti. 8 ul di tampone sono stati aggiunti a questo campione per migliorare il segnale di fluorescenza. Per risparmiare sui vetrini consumabili Quantom, ricicliamo i vetrini lavandoli nei sistemi di pulizia vetrini iWash® di Imrali Inventions (www.imraliinventions.com).
A questi tubi è stato aggiunto il biossido di cloro in diverse concentrazioni, per diverse durate? La concentrazione di biossido di cloro variava da 0,5 µl (0,5 ppm) a 5 µl (5 ppm) e la durata dell'esposizione al campione variava da 30 minuti a 30 secondi.
Per ogni esperimento basato sul tempo e sulla durata, sono state preparate due provette per mantenere costante il fattore di diluizione. A seconda della quantità di biossido di cloro aggiunta al tubo sperimentale, la stessa quantità di acqua è stata aggiunta al tubo di controllo.
Da questi tubi di controllo e sperimentali, 6 µl del campione sono stati prelevati utilizzando una pipetta elettronica e posti sui vetrini per il conteggio delle cellule M50. I vetrini sono stati posti nella centrifuga QUANTOM per 8 minuti a 300 RCF (forza centrifuga relativa) e quindi posti nel contatore di cellule microbiche Quantom per effettuare una misurazione di riferimento (controllo) e un'altra misurazione dal tubo sperimentale.
La configurazione ottimale del contatore di cellule microbiche Quantom per il protocollo MRSA che abbiamo riscontrato durante il test è stata stabilita in Fattore di diluizione 2, Dimensione minima dell'oggetto fluorescente 0.4 um, Dimensione massima dell'oggetto fluorescente 15 μm Rotondità 50%, Livello di scolorimento 7 e Sensibilità di rilevamento 7.
Preparazione di biossido di cloro
Il biossido di cloro tradizionale, chiamato MMS, veniva preparato come biossido di cloro tradizionale, chiamato MMS, veniva preparato come soluzione utilizzando due componenti, soluzione di clorito di sodio (soluzione al 25% in acqua) e soluzione di acido cloridrico al 4%. Una goccia di ciascuna di queste soluzioni è stata posta in una provetta Eppendorf sterile da 1,5 ml e lasciata attivare per 30 secondi. Inoltre, sono stati condotti ulteriori esperimenti utilizzando una nuova generazione di biossido di cloro chiamato CDSplus, un prodotto brevettato fabbricato da Aquarius Pro-Life come prodotto per il trattamento dell'acqua. Questa è una forma tamponata di biossido di cloro a un pH standard di 7 e una concentrazione di 3000 ppm quando attivo (250 ml). Dal CDSplus attivato (250 ml) sono stati estratti 83 µl = 1 ppm, 166 µl = 2 ppm; 0,25 ml = 3 ppm.
Protocolli sperimentali
Varie concentrazioni di biossido di cloro
Sono stati utilizzati MMS e CDSplus. L'intervallo era da 1 ppm a 5 ppm. Sono stati utilizzati i tempi di MMS e CDSplus. L'intervallo era compreso tra 1 ppm e 5 ppm. Il tempo di esposizione al biossido di cloro variava da 30 minuti a 30 secondi. Negli esperimenti iniziali non era chiaro quanto tempo sarebbe stato necessario per l'inibizione, ma si è rapidamente dimostrato che era inferiore a un minuto di esposizione. La maggior parte degli esperimenti, quindi, ha avuto un tempo di esposizione di 1 minuto.
Risultati Primi esperimenti
Abbiamo iniziato a prendere diverse concentrazioni di biossido di cloro nell'MMS tradizionale e abbiamo testato queste concentrazioni con MRSA in soluzione per tempi diversi che andavano da 30 minuti a 30 secondi. 1μl di biossido di cloro equivale a una concentrazione di 1 ppm. La concentrazione più bassa di biossido di cloro utilizzata per eradicare completamente l'MRSA in questi esperimenti era di 0,5 ppm, con un tempo di esposizione di 30 secondi.
La seguente tabella 1 mostra le diverse concentrazioni in funzione del tempo, con la concentrazione della cella MRSA misurata dal contatore di cellule Quantom. Come si può vedere, per tutte le concentrazioni di biossido di cloro che vanno da 1 a 5 ppm, e il tempo di esposizione da 30 minuti a 30 secondi, l'inibizione della crescita di MRSA è stata del 99,99% durante tutti questi esperimenti.
Tabella 1 Confronto delle conte batteriche prima e dopo l'esposizione al biossido di cloro.
Esperimento 1
La tabella 2 mostra i numeri di conteggio delle cellule per le 6 concentrazioni di biossido di cloro utilizzate, vale a dire: sono stati utilizzati 0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 ppm ed è stato misurato un conteggio di base per ciascuna concentrazione. L'esperimento numero 0 è il conteggio di riferimento (controllo) per ciascun gruppo di esperimenti che utilizza diverse concentrazioni di biossido di cloro. Per ogni concentrazione, l'esperimento è stato ripetuto 5 volte, indicando le concentrazioni medie.
Dagli esperimenti iniziali, poiché si è scoperto che il biossido di cloro uccide il 99,99% dei batteri MRSA a concentrazioni di 5 ppm per soli 30 secondi, tutti gli altri esperimenti hanno utilizzato un tempo di esposizione di un minuto come standard, mentre hanno provato diverse concentrazioni.
In questo esperimento, le concentrazioni di ClO2 vanno da 0,5
- Sono state scattate 5 ppm, utilizzando l'MMS tradizionale. Ad ognuna delle 5 concentrazioni, il tasso di inibizione era del 100%; fare riferimento alla tabella 2 e alla figura
- La Figura 1 mostra la ripetibilità della conta dei batteri MRSA utilizzando diverse concentrazioni che vanno da 1 a 5 ppm. È stato effettuato un conteggio di base per ciascuna concentrazione; questo è stato ripetuto 5 volte. In tutti e 5 i replicati, l'inibizione della crescita di MRSA è stata del 100%.
La Figura 2 confronta il conteggio delle cellule MRSA con la concentrazione di MMS in 1 minuto. L'area coperta è uguale al numero di celle. I conteggi iniziali per ciascuna concentrazione sono visualizzati sul lato sinistro del grafico e i conteggi finali sono visualizzati sul lato destro del grafico. Il tasso di inibizione è stato del 100% per tutte le concentrazioni di biossido di cloro, con un tempo di esposizione di 1 minuto.
Figura 1 Biossido di cloro a diverse concentrazioni utilizzando MMS
Figura 2 Diverse concentrazioni di MMS tradizionale per una durata di 1 min.
Tabella 2 Biossido di cloro (MMS tradizionale) a diverse concentrazioni ripetute 5 volte
La tabella 3 confronta le concentrazioni di 1, 2, 3, 4 e 5 ppm per una tabella 3 confronta le concentrazioni di 1, 2, 3, 4 e 5 ppm per un'esposizione di 1 minuto al biossido di cloro. Il controllo è stato confrontato con quello sperimentale per le diverse concentrazioni. Per tutte queste concentrazioni di biossido di cloro, il tasso di inibizione era del 100%.
Esperimento 2: utilizzo di CDSplus
Lo stesso esperimento di cui sopra è stato ripetuto utilizzando la generazione CDS plus, utilizzando concentrazioni di 1-3 ppm. Ad ognuna delle 3 concentrazioni, il tasso di inibizione è stato nuovamente del 100%; Vedere la Tabella 4 e la Figura 3. La Figura 3 mostra l'eradicazione delle cellule MRSA utilizzando diverse concentrazioni di CDSplus, vale a dire 1, 2 e 3 ppm. È stato misurato un conteggio di base per il gruppo di controllo, quindi ogni concentrazione di CDS plus è stata aggiunta e ripetuta due volte.
Per tutte le concentrazioni, il tasso di inibizione era del 100%.
La tabella 4 confronta le concentrazioni di 1, 2 e 3 pp per un'esposizione di 60 secondi al biossido di cloro, utilizzando il CDS plus di nuova generazione.
Il controllo è stato confrontato con quello sperimentale per le diverse concentrazioni.
Figura 3 MRSA-CDSPlus con diverse concentrazioni.
La Figura 4 confronta il conteggio delle cellule MRSA con la concentrazione di biossido di cloro (CDS plus) per 1 minuto. La riga superiore mostra il conteggio delle celle di riferimento per il gruppo di controllo. La riga inferiore mostra il conteggio delle cellule MRSA dopo aver esposto le cellule per 1 minuto a diverse concentrazioni di biossido di cloro; il tasso di inibizione era del 100%.
Figura 4 Diversa concentrazione di CDSPlus per 60 secondi.
Tabella 4 Biossido di cloro (CDSplus) a diverse concentrazioni per un'esposizione di 1 minuto Tabella 4 Biossido di cloro (CDSplus) a diverse concentrazioni per un'esposizione di 1 minuto
Conclusioni
MRSA è versatile e imprevedibile. La loro adattabilità genetica e MRSA è versatile e imprevedibile. La sua adattabilità genetica e la comparsa in serie di ceppi epidemici di successo significano che rimane una grave minaccia per la salute umana.
La mortalità costantemente elevata associata all'infezione invasiva da MRSA, nonostante la FDA abbia approvato più antibiotici efficaci contro l'MRSA dal 2014, evidenzia la necessità di studi di alta qualità per determinare la gestione ottimale per questi pazienti. In questi esperimenti in vitro, l'efficacia del biossido di cloro contro MRSA è stata costantemente dimostrata, con un'inibizione della crescita del 99,99% -100% anche alle più piccole concentrazioni di 0,5 ppm.
Data la comprovata sicurezza del biossido di cloro negli esperimenti sugli animali e sull'uomo fino ad oggi, c'è un urgente bisogno di studi clinici di alta qualità per determinare l'efficacia del biossido di cloro negli individui infetti da MRSA oggi.
Questi studi saranno condotti dalla comunità clinica, partendo da sperimentazioni cliniche individuali in diversi paesi del mondo, con la creazione di una rete di sperimentazioni cliniche per raccogliere tutti i dati e sviluppare protocolli clinici sicuri ed efficaci. Per quanto riguarda la sicurezza, in un esperimento attentamente progettato, il tempo caratteristico richiesto per uccidere un microbo è risultato essere solo di pochi millisecondi. Essendo il ClO 2 un composto abbastanza volatile, il suo tempo di contatto (la sua permanenza sulla superficie trattata) è limitato a pochi minuti.
Anche se questo soggiorno è abbastanza sicuro (essendo almeno 3 ordini di grandezza più lungo del momento della morte) per inattivare tutti i batteri in
la superficie del corpo è troppo corta perché ClO 2 penetri più in profondità di pochi decimi di millimetro; pertanto, non può causare alcun danno reale a un organismo molto più grande di un batterio.
Numerose sono anche le testimonianze dell'utilizzo del biossido di cloro da parte di volontari umani per l'eradicazione di molte malattie infettive, tra cui la malaria e l'HIV, ma uno dei pionieri in Africa, Jim Humble. C'è molta polemica su questa prova aneddotica, ma il numero di testimoni che testimoniano non può essere ignorato: la politica e gli interessi personali devono essere messi da parte e la scienza deve esaminare le prove a beneficio dell'umanità! 34,35
Riferimenti e documento originale dal seguente link:
