二酸化塩素を使用したMRSA根絶
抗菌薬耐性感染症（AMR）は現在、ヨーロッパと米国だけで毎年少なくとも50.000人の命を奪っており、世界の他の地域ではさらに数十万人が死亡しています。 ヨーロッパの15か国では、血流中の黄色ブドウ球菌感染症の10％以上が、メチシリン耐性菌（MRSA）によって引き起こされています。
そしてこれらの国のいくつかは50％に近い抵抗率を登録しています。 1さらに、抗生物質耐性感染症の数が増加している一方で、新しい抗生物質の数は減少しています。 1,2したがって、ADRには新しく新しい治療法を模索することが不可欠であり、これがこの研究の前提です。それ以上の耐性を生み出さないMRSAを根絶するために天然物質を使用することです。 二酸化塩素は、テストされた他の天然物質と比較して最も効果的であったため、invitroで使用される二酸化塩素がこの研究の主な焦点となっています。
キーワード：抗菌剤耐性菌、メチシリン耐性、黄色ブドウ球菌、
毒素性ショック症候群、エリスロマイシン、二酸化塩素
略語：MRSA、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌; AMR。 抗菌剤耐性; TSST-1、毒素-1毒素性ショック症候群; ClO 2、二酸化塩素、PVL、パントン-バレンタインロイコシジン; MSSA、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌
はじめに
病院やICUで獲得した院内感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）などの抗生物質耐性菌によって引き起こされることがよくあります。 抗生物質に対するこの耐性は、高い罹患率、死亡率、および医療施設の高いコストを伴います。
¿Que es MRSA？
黄色ブドウ球菌は、カタラーゼとコアグラーゼの両方であるグラム陽性ココナッツです+。 黄色ブドウ球菌は、好中球の活性化、感染部位への移動、細菌のオプソニン作用、食作用、およびその後の好中球を介した破壊を含む、好中球を介した死と戦うための多数の免疫回避戦略を開発するために進化してきました。 最大40の黄色ブドウ球菌免疫回避分子が知られており、これらの回避タンパク質の新しい機能が特定されています。
それらは、アルファ毒素、ベータ毒素、ガンマ毒素、デルタ毒素、エクスフォリアチン、エンテロトキシン、パントン-バレンタインロイコシジン（PVL）、および毒素性ショック症候群毒素1（TSST-1）を含むさまざまな毒素を産生します。 エンテロトキシンとTSST-1は毒素性ショック症候群に関連しています。 進行性多巣性白質脳症は、皮膚と肺の壊死性感染症に関連しており、肺炎と骨髄炎の重要な病原性因子です。 3
黄色ブドウ球菌は、以下を含む幅広い病原性因子を発現します
毒素（溶血素およびロイコシジン）、免疫回避表面因子（例、カプセルおよびプロテインA）、および組織浸潤を促進する酵素（例、ヒアルロニダーゼ）。 3
MRSAによるコロニー形成は感染のリスクを高め、感染株は最大50〜80％の症例でコロニー形成株と一致します。 4,5
コートやホワイトタイからペンや携帯電話まで、皮膚に接触するほとんどすべてのものがMRSAの感染の媒介物として機能する可能性があります。
植民地化は長期間続く可能性があります。 MRSAは家庭環境でも存続する可能性があり、根絶の試みを複雑にします。 6
同時に、菌株は同じ宿主内で進化し、さらには置き換わることがわかっているため、コロニー形成は静的ではありません。 7
薬剤耐性
MRSAは、抗生物質耐性遺伝子を保有するMGEを複数の独立した機会に獲得しました。 ペニシリン（blaZ）、トリメトプリム（dfrAおよびdfrK）、エリスロマイシン（ermC）、クリンダマイシン（構成的に発現されるermC）、およびテトラサイクリン（tetKおよびtetL）に対する耐性は、挿入配列、トランスポゾン、および場合によっては両方のMRSAのプラスミドで確認されています。メチシリン。 感受性黄色ブドウ球菌（MSSA）。 8おそらく病院内の強い選択的圧力を反映して、抗生物質耐性は、HA-MRSA株の消毒剤または重金属（例えば、第9級アンモニア化合物、水銀、またはカドミウム）に対する耐性と遺伝的に関連していることがよくあります。 XNUMX
二酸化塩素とは何ですか？
現在商業的に重要な化合物である二酸化塩素（ClO 2）は、最近の発見ではありません。 このガスは、1811年にハンフリーデービーによって塩酸と塩素酸カリウムを反応させることによって最初に生成されました。 これにより、当時呼ばれていた「ユークロリン」が生成されました。 1834年にアルカリパルプ漂白を発明したワットとバージェスは、最初の特許で漂白剤としてユークロリンに言及しました。 10,11
二酸化塩素は後に漂白剤として知られるようになり、後に消毒剤として知られるようになりました。 しかし、塩素酸鉱物からのClO 2の生成は複雑であり、ガスは爆発性であるため、できませんでした。
1940年にOlinCorporationが亜塩素酸ナトリウム粉末を製造するまでは、実用的に簡単に使用できます。
二酸化塩素は、必要に応じて亜塩素酸塩から放出されるようになりました。 地方自治体の水道では、これは通常、亜塩素酸塩溶液に塩素を加えることによって行われ、実験室では亜塩素酸塩溶液に酸を加えることによって行われます。 アリガーは1978年に10,11でそれを示しました
ClO 2は、個々のユーザーが局所的に塗布することができます。
ClO 2は、分子量67,46の小分子であり、安定したラジカルを形成します。 12 ClO 2は酸化剤であり、電子を捕獲することによって亜塩素酸イオン（ClO 2-）に還元されます（ClO 2 + e-→ClO2-）。 酸化還元電位（Eº）は0,95 Vと比較的高いため、ヒトマイクロバイオームに害を及ぼすことはありません。 13,14
二酸化塩素（ClO2）溶液
二酸化塩素は、殺菌性、殺ウイルス性、殺胞子性、殺虫性、殺藻性、殺真菌性です。 15強力な酸化剤である二酸化塩素は、強力な抗ウイルス活性を生み出す1〜100 ppmの範囲の濃度の微生物を阻害または破壊し、99,9秒の感作の処理でウイルスの15％以上を不活化することが報告されています。
15-19
さらに、ClO 2は水に非常に溶けやすく、オゾンとは異なり、バイオフィルムと反応しないため、バイオフィルムを迅速に除去できます20。
バイオフィルムからの細胞外多糖類。 このようにして、ClO 2はバイオフィルムにすばやく浸透し、フィルム内に生息する微生物に到達して殺すことができます。これは、Naturalの両方に対処することとは異なる大きな利点です。
と対症療法。 ClO2溶液が殺ウイルス活性を持っているという多くの報告があります。 21-25に対する不活化濃度
ポリオウイルスでは、さまざまなウイルスが1〜2ppmです。 21,22 SARSの原因となるコロナウイルスの2,19ppm。 23 A型肝炎ウイルスでは7.5ppm、ロタウイルスでは24および0,2ppm。 25
二酸化塩素の安全性
多くの評価で、無毒のClO2化合物が示されています。 XNUMX年間の使用は、健康への悪影響を示していません。
主な使用分野は、水道の消毒、不要な味や臭いの除去、パルプ、紙、繊維産業での漂白です。
毒性試験には、飲料水中のClO 2の摂取、組織培養への添加、血液への注射、種子が含まれます。
消毒、昆虫の卵の26,27消毒、動物の皮下およびマウスの脳への注射、1500匹以上のラットに投与された火傷、および植物の茎への注射。 標準的な検査には、エイムス突然変異、チャイニーズハムスター、ウサギの目、皮膚の擦過傷、薬力学、および奇形学が含まれます。 28
ある研究では、人間のボランティアが2ppmまでの溶液でClO2またはClO24¯を飲んだが、悪影響は見られなかった。 28
いくつかの研究は、生殖毒性または催奇形性への影響を調べました。 胎児の奇形や出産の証拠はありません。
飲料と皮膚経路の両方で、最大2ppmのClO100濃度の欠陥。 29-31
長時間の摂食では、毒性は主に赤血球で発生します。 1000 mg / Lを6か月間慢性的に与えられたラットは、有意な血液学的変化を示さなかった。 ただし、9か月後、赤血球数、ヘマトクリット値、およびヘモグロビンはすべての治療群で減少しました。
長期毒性の欠如、しかし低レベルのベースラインは、32匹のラットと33匹のミツバチが2年間高用量のClO100を与えられたXNUMXつの別々の研究で劇的に示されています。 給水に最大XNUMXppmを添加しても、有害な影響は観察されませんでした。
材料および方法
この調査研究では、地元の認定臨床検査室から提供された血液寒天プレート上で増殖したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）を使用しました。
MRSA文化
安全クラス2キャビネットで、血液寒天プレート（コロンビア寒天培地）から、滅菌ループを使用して分離培養物からMRSAサンプルを採取し、5 mlのトリプシン大豆ブロス（TSB）を入れた滅菌チューブに入れました。 これらの培養管を摂氏37度で48時間インキュベートした。 これらの培養管は、摂氏4度の冷蔵庫に最大10日間保管でき、この場合もサンプルが作成されます。
バクテリアを数える
細菌を定量化するための最も一般的な方法のXNUMXつは、コロニー形成単位（CFU）を数えることです。 この広く使用されている方法は単純で、細胞の生存率についての優れた一般的なアイデアを提供し、低濃度の細菌にも敏感です。
大きな欠点のXNUMXつは、せいぜい推定値の結果が得られるまでに数日かかることです。 コロニーはXNUMXつまたはXNUMXの細胞から発生する可能性があり、サンプルの準備は、サンプルの状態に応じて、テクノロジーごとに、また毎回異なる可能性があります。 精度を上げるために、Logos Biosystems（logosbio.com）のQUANTOMTx微生物細胞カウンターをこの調査に使用しました。 これは、自動化された画像ベースのセルカウンターであり、個々の細菌細胞を数分で識別およびカウントできます。
QUANTOM Txは、複数の蛍光染色された細胞画像の焦点を合わせ、キャプチャし、分析して、細菌細胞を高感度かつ高精度で検出します。 高度な細胞検出および除去アルゴリズムが含まれており、最小のグループでも個々の細菌細胞を正確に識別できます。 これらの実験では、生細胞または生細胞を検出するために生細胞染色キットを使用します。
Quantom Microbial Cell Counterが比較され、フローサイトメトリーや血球計算盤の測定と同じくらい正確であることがわかりましたが、各カウントにかかる時間は30秒以内で、グループを区別できるため、時間が大幅に短縮されます。 染色された細胞は、QUANTOM I Cell Loading Bufferと混合され、QUANTOM M50 Cell Counting Slidesにロードされ、QUANTOM Centrifugeで遠心分離されて、単一の焦点面に沿って細胞を固定し、均一に分散させて、一貫した正確な細胞検出を保証します。 カウント結果と画像は、カウント後すぐに表示および保存できます。
Quantomのサンプルを準備するために、事前にキャリブレーションされたDLAB電子ピペットを使用して10マイクロリットル（ul）の培地を採取し、滅菌1,5mlエッペンドルフチューブに入れました。 これに2ulの生細胞染色色素を添加し、Heraeusインキュベーター内で摂氏37度で30分間インキュベートしました。 蛍光シグナルを増強するために、8ulのバッファーをこのサンプルに加えました。 Quantomの消耗品スライドを節約するために、ImraliInventionsiWash®スライドクリーニングシステム（www.imraliinventions.com）でスライドを洗浄してリサイクルします。
これらのチューブに、二酸化塩素をさまざまな濃度でさまざまな期間添加しましたか？ 二酸化塩素濃度は0,5µl（0,5 ppm）から5 µl（5 ppm）の範囲であり、サンプルへの曝露時間は30分から30秒の範囲でした。
時間と期間に基づく各実験では、希釈係数を一定に保つためにXNUMX本のサンプルチューブを用意しました。 実験管に加えられた二酸化塩素の量に応じて、同じ量の水が対照管に加えられた。
これらのコントロールチューブと実験チューブから、電子ピペットを使用して6 µlのサンプルを採取し、M50細胞数スライドに配置しました。 スライドをQUANTOM遠心分離機に8RCF（相対遠心力）で300分間置き、次にQuantom微生物セルカウンターに置いて、参照測定（コントロール）と実験チューブからの別の測定を行いました。
テスト中に見つかったMRSAプロトコルのQuantomMicrobial Cell Counterの最適な構成は、希釈係数2、蛍光オブジェクトの最小サイズ0.4um、蛍光オブジェクトの最大サイズ15μm真円度50％、デクラスターレベル7、および検出感度で確立されました。 7。
二酸化塩素の準備
MMSと呼ばれる従来の二酸化塩素はMMSと呼ばれる従来の二酸化塩素として調製されました。MMSと呼ばれる従来の二酸化塩素は、亜塩素酸ナトリウム溶液（25％水溶液）と4％塩酸溶液の1,5つの成分を使用した溶液として調製されました。 これらの溶液のそれぞれからの30滴を滅菌7mlエッペンドルフチューブに入れ、3000秒間活性化させた。 さらに、AquariusPro-Lifeが水処理製品として製造した独自の製品であるCDSplusと呼ばれる新世代の二酸化塩素を使用してさらに多くの実験が行われました。 これは、標準pH 250、活性時の濃度250 ppm（83 ml）の二酸化塩素の緩衝液です。 活性化されたCDSplus（1 ml）から、166 µl = 2 ppm、0,25 µl = 3ppmが抽出されました。 XNUMX ml = XNUMX ppm
実験プロトコル
二酸化塩素のさまざまな濃度
MMSとCDSplusを使用しました。 範囲は1ppm〜5ppmでした。 MMSとCDSplusの時間を使用しました。 範囲は1ppm〜5ppmでした。 二酸化塩素への暴露時間は30分から30秒の範囲でした。 最初の実験では、抑制に必要な時間は明確ではありませんでしたが、1分未満の曝露であることがすぐに示されました。 したがって、ほとんどの実験の曝露時間はXNUMX分でした。
結果初期実験
従来のMMSでさまざまな濃度のクロロベースの二酸化炭素を摂取し始め、30分から30秒までのさまざまな時間、溶液中のMRSAでこれらの濃度をテストしました。 1μlの二酸化塩素は1ppmの濃度に相当します。 これらの実験でMRSAを完全に根絶するために使用された二酸化塩素の最低濃度は0,5ppmであり、曝露時間は30秒でした。
以下の表1は、時間の関数としてのさまざまな濃度を示しています。MRSA細胞濃度は、Quantomセルカウンターによって測定されています。ご覧のとおり、1〜5 ppmの範囲のすべての二酸化塩素濃度、および30分から30秒で、MRSA増殖阻害はこれらすべての実験を通して99,99％でした。
表1二酸化塩素への曝露前後の細菌数の比較。
実験1
表2は、使用した二酸化塩素の6つの濃度、つまり0,5、1、2、3、4、および5 ppmのセル数を示し、各濃度のベースライン数を測定しました。 実験番号0は、さまざまな濃度の二酸化塩素を使用した各実験グループのベースライン（コントロール）カウントです。 各濃度について、実験を5回繰り返し、平均濃度を示しました。
最初の実験から、二酸化塩素は99,99 ppmの濃度でMRSA菌の5％をわずか30秒間殺すことがわかったため、他のすべての実験では、さまざまな濃度を試しながら、XNUMX分の曝露時間を標準として使用しました。
この実験では、ClO2濃度は0,5の範囲です
- 従来のMMSを使用して5ppmを取得しました。 5つの濃度のそれぞれで、阻害率は100％でした。 表2と図を参照してください
- 図1は、1〜5ppmの範囲のさまざまな濃度を使用したMRSA細菌数の再現性を示しています。 各濃度についてベースラインカウントを取得しました。 これを5回繰り返した。 5回の繰り返しすべてにおいて、MRSA増殖阻害は100％でした。
図2は、MRSA細胞数と1分間のMMS濃度を比較しています。 カバーされる領域は、セル数と同じです。 各濃度の初期カウントはグラフの左側に表示され、最終カウントはグラフの右側に表示されます。 阻害率はすべての二酸化塩素濃度で100％であり、暴露時間は1分でした。
図1MMSを使用したさまざまな濃度の二酸化塩素
図2分間の従来のMMSのさまざまな濃度。
表2回繰り返されたさまざまな濃度の二酸化塩素（従来のMMS）
表3は、二酸化塩素への1分間の曝露に対する2、3、4、5、および3 ppmの濃度を比較した表1の2、3、4、5、および1ppmの濃度を比較しています。 対照は、異なる濃度について実験のものと比較された。 これらすべての濃度の二酸化塩素について、抑制率は100％でした。
実験2：CDSplusを使用する
上記と同じ実験を、1〜3 ppmの濃度を使用して、CDSplus世代を使用して繰り返しました。 3つの濃度のそれぞれで、阻害率は再び100％でした。 表4および図3を参照してください。図3は、さまざまな濃度のCDSplus、つまり1、2、および3ppmを使用したMRSA細胞の根絶を示しています。 対照群のベースラインカウントを測定した後、CDS plusの各濃度を追加し、XNUMX回繰り返しました。
すべての濃度で、阻害率は100％でした。
表4は、新世代のCDS plusを使用して、二酸化塩素に1秒間曝露した場合の2、3、および60ppの濃度を比較しています。
対照は、異なる濃度について実験のものと比較された。
図3さまざまな濃度のMRSA-CDSPlus。
図4は、MRSA細胞数と二酸化塩素濃度（CDSプラス）を1分間比較したものです。 一番上の行は、コントロールグループの参照セル数を示しています。 一番下の行は、細胞をさまざまな濃度の二酸化塩素に1分間さらした後のMRSA細胞数を示しています。 抑制率は100％でした。
図4秒間のCDSPlusの異なる濃度。
表4分間の曝露に対するさまざまな濃度の二酸化塩素（CDSplus）表1 4分間の曝露に対するさまざまな濃度の二酸化塩素（CDSplus）
結論
MRSAは用途が広く、予測不可能です。 それらの遺伝的適応性とMRSAは用途が広く、予測不可能です。 その遺伝的適応性と成功した流行株の連続的な出現は、それが人間の健康に対する主要な脅威であり続けることを意味します。
FDAが2014年以来MRSAに対して有効な複数の抗生物質を承認しているという事実にもかかわらず、侵襲性MRSA感染に関連する持続的に高い死亡率は、これらの患者の最適な管理を決定するための高品質の試験の必要性を浮き彫りにします。 これらのinvitro実験では、MRSAに対する二酸化塩素の有効性が一貫して実証されており、99,99 ppmの最小濃度でも100％〜0,5％の増殖阻害が見られます。
これまでの動物およびヒトの実験で二酸化塩素の安全性が証明されていることを考えると、今日MRSAに感染した個人における二酸化塩素の有効性を決定するための高品質の臨床試験が緊急に必要とされています。
これらの研究は、世界のさまざまな国での個々の臨床試験から始まり、すべてのデータを収集し、安全で効果的な臨床プロトコルを開発するための臨床試験のネットワークを作成することで、臨床コミュニティによって実施されます。 安全性に関しては、慎重に設計された実験で、微生物を殺すのに必要な特徴的な時間はわずか数ミリ秒であることがわかりました。 ClO 2はかなり揮発性の化合物であるため、その接触時間（処理された表面での耐久性）は数分に制限されます。
この滞在は十分に安全ですが（死の時より少なくとも3桁長い）、
体の表面が短すぎて、ClO2がXNUMX分の数ミリメートルより深く浸透することはできません。 したがって、バクテリアよりはるかに大きい生物に実際の害を及ぼすことはできません。
マラリアやHIVを含む多くの感染症を根絶するために、ボランティアが二酸化塩素を使用したという証言もたくさんありますが、アフリカの先駆者の34,35人であるジムハンブルです。 この事例証拠については多くの論争がありますが、証言する証人の数は無視できません。政治と個人的な利益を脇に置き、科学が人類の利益のために証拠を調査する必要があります。 XNUMX
次のリンクからの参照と元のドキュメント：
