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Erradicação de MRSA usando dióxido de cloro

mrsaAs infecções resistentes a antimicrobianos (AMRs) ceifam atualmente pelo menos 50.000 vidas a cada ano na Europa e apenas nos Estados Unidos, e muitas centenas de milhares morrem em outras áreas do mundo. Em 15 países europeus, mais de 10% das infecções por Staphylococcus aureus na corrente sanguínea são causadas por cepas resistentes à meticilina (MRSA),

e vários desses países registram taxas de resistência próximas a 50%. 1 Além disso, enquanto o número de infecções resistentes a antibióticos está aumentando, o número de novos antibióticos está diminuindo. 1,2 Portanto, é imprescindível que novos e inéditos tratamentos sejam buscados para ADRs, e esta é a premissa desta pesquisa: usar substâncias naturais para erradicar o MRSA, que não criem mais resistência. O dióxido de cloro utilizado in vitro, tem sido nosso foco principal desta pesquisa, uma vez que foi o mais eficaz, se comparado a outras substâncias naturais testadas.

Palavras-chave: cepas resistentes a antimicrobianos, resistentes à meticilina, Staphylococcus aureu,

síndrome do choque tóxico, eritromicina, dióxido de cloro

 

Abreviaturas: MRSA, Staphylococcus aureus resistente à meticilina; AMR. resistente a antimicrobianos; TSST-1, síndrome do choque tóxico da toxina-1; ClO2, Dióxido de Cloro, PVL, Panton-Valentine Leukocidin; MSSA, saphylococcus aureus sensível à meticilina

 

Introdução

As infecções hospitalares adquiridas em hospitais ou UTIs são frequentemente causadas por bactérias resistentes a antibióticos, como Staphylococcus Aureus resistente à meticilina (MRSA). Essa resistência aos antibióticos é acompanhada por altas taxas de morbimortalidade e pelo alto custo das unidades de saúde.

O que é MRSA?

Staphylococcus aureus é um coco gram-positivo que é tanto catalase quanto coagulase +. Staphylococcus aureus evoluiu para desenvolver várias estratégias de evitação imunológica para combater a morte mediada por neutrófilos, incluindo ativação de neutrófilos, migração para o local da infecção, opsonização bacteriana, fagocitose e subsequente destruição mediada por neutrófilos. São conhecidas até 40 moléculas de evasão imunológica de S. aureus, e novas funções estão sendo identificadas para essas proteínas de evasão.

Eles produzem uma variedade de toxinas, incluindo alfa-toxina, beta-toxina, gama-toxina, delta-toxina, esfoliatina, enterotoxinas, leucocidina Panton-Valentine (PVL) e Toxina 1 da Síndrome de Choque Tóxico (TSST-1); enterotoxinas e TSST-1 estão associadas à síndrome do choque tóxico; A leucoencefalopatia multifocal progressiva está associada a infecções necróticas da pele e dos pulmões e é um importante fator de virulência para pneumonia e osteomielite. 3

S. aureus expressa uma ampla gama de fatores de virulência, incluindo

toxinas (hemolisinas e leucocidinas), fatores de superfície imunoevasivos (por exemplo, cápsula e proteína A) e enzimas que promovem a invasão do tecido (por exemplo, hialuronidase). 3

A colonização por MRSA aumenta o risco de infecção, e as cepas infectantes coincidem com as cepas colonizadoras em até 50–80% dos casos. 4,5

Quase tudo em contato com a pele pode servir como fomite na transmissão do MRSA, desde jalecos e gravatas brancas até canetas e telefones celulares.

A colonização pode persistir por longos períodos. O MRSA também pode persistir no ambiente doméstico, complicando as tentativas de erradicação. 6

Ao mesmo tempo, a colonização não é estática, pois descobriu-se que as cepas evoluem e até se substituem no mesmo hospedeiro. 7

 

Resistência a droga

MRSA adquiriu MGE carregando genes de resistência a antibióticos em várias ocasiões independentes. Resistência à penicilina (blaZ), trimetoprima (dfrA e dfrK), eritromicina (ermC), clindamicina (ermC expresso constitutivamente) e tetraciclinas (tetK e tetL) foram identificadas em sequências de inserção, transposons e, às vezes, plasmídeos em MRSA e em meticilina. Staphylococcus aureus suscetível (MSSA). 8 Provavelmente refletindo as fortes pressões seletivas dentro do ambiente hospitalar, a resistência aos antibióticos é frequentemente geneticamente relacionada à resistência a desinfetantes ou metais pesados ​​(por exemplo, compostos de amônia quaternária, mercúrio ou cádmio) entre as cepas de HA-MRSA. 9

O que é dióxido de cloro?

O agora comercialmente importante composto de dióxido de cloro (ClO 2) não é uma descoberta recente. O gás foi produzido pela primeira vez por Humphrey Davy em 1811 pela reação de ácido clorídrico com clorato de potássio. Isso produziu o "ecloro", como era chamado então. Watt e Burgess, que inventaram o branqueamento de polpa alcalina em 1834, mencionaram o eucloro como um agente de branqueamento em sua primeira patente. 10,11

Mais tarde, o dióxido de cloro tornou-se conhecido como alvejante e mais tarde um desinfetante. A produção de ClO 2 a partir do clorato mineral é complicada, no entanto, e o gás é explosivo, então não poderia

ser facilmente usado praticamente até a produção de clorito de sódio em pó pela Olin Corporation em 1940.

O dióxido de cloro agora podia ser liberado do sal de clorito quando necessário. No abastecimento de água municipal, isso geralmente é feito adicionando cloro à solução de clorito e, no laboratório, adicionando um ácido à solução de clorito. Alliger mostrou em 1978, 10,11 que
O ClO 2 pode ser aplicado topicamente pelo usuário individual.

 

ClO 2 é uma pequena molécula com peso molecular de 67,46 e forma um radical estável. 12 ClO 2 é um oxidante, que é reduzido a um íon clorito (ClO 2 -) pela captura de um elétron (ClO 2 + e- → ClO 2 -). O potencial redox (Eº) é relativamente alto, como 0,95 V, portanto não prejudica o microbioma humano. 13,14

 

Solução de dióxido de cloro (ClO2)

O dióxido de cloro é: bactericida, virucida, esporicida, cisticida, algicida e fungicida. 15 Foi relatado que o dióxido de cloro, um oxidante forte, inibe ou destrói microorganismos em concentrações que variam de 1 a 100 ppm que produzem atividade antiviral potente, inativando> ou = 99,9% dos vírus com um tratamento de sensibilização de 15 segundos.
15-19

Além disso, o ClO 2 pode remover biofilmes rapidamente 20 porque é altamente solúvel em água e, ao contrário do ozônio, não reage com
polissacarídeos extracelulares de biofilme. Desta forma, o ClO 2 pode penetrar nos biofilmes rapidamente para atingir e matar os micróbios que vivem dentro do filme: uma grande vantagem que é diferente de abordar ambos para Natural
e Medicina Alopática. Existem muitos relatos de que a solução de ClO 2 tem atividade viricida. 21-25 A concentração de inativação contra

vários vírus é de 1-2 ppm no poliovírus. 21,22 2,19 ppm no coronavírus que causa a SARS. 23 7.5 ppm no vírus da hepatite A, 24 e 0,2 ppm no rotavírus. 25

Segurança de dióxido de cloro

Muitas avaliações mostraram compostos não tóxicos de ClO 2. Cinco décadas de uso não indicaram nenhum efeito adverso à saúde.

As principais áreas de uso têm sido a desinfecção de fontes de água, remoção de gostos e odores indesejáveis ​​e branqueamento nas indústrias de papel e celulose e têxteis.

Os testes de toxicologia incluem ingestão de ClO 2 na água potável, acréscimos à cultura de tecidos, injeções no sangue, sementes
desinfecção, 26,27 desinfecção de ovos de insetos, injeções sob a pele de animais e no cérebro de camundongos, queimaduras administradas em mais de 1500 ratos e injeções em caules de plantas. Os testes padrão incluem mutação de Ames, hamster chinês, olho de coelho, abrasão da pele, farmacodinâmica e teratologia. 28

Em um estudo, voluntários humanos beberam ClO 2 ou ClO 2 ¯ em solução até 24 ppm e não mostraram efeitos adversos. 28

Vários estudos examinaram os efeitos na toxicidade reprodutiva ou na teratologia. Não há evidência de malformação fetal ou nascimento.
defeitos nas concentrações de ClO 2, tanto na via da bebida quanto na via da pele, até 100 ppm. 29-31

Com alimentação prolongada, a toxicidade ocorre principalmente nas células vermelhas do sangue. Os ratos alimentados com 1000 mg / l cronicamente durante 6 meses não mostraram alterações hematológicas significativas. No entanto, após 9 meses, as contagens de glóbulos vermelhos, hematócrito e hemoglobina diminuíram em todos os grupos de tratamento.

Ausência de toxicidade em longo prazo, mas a linha de base de baixo nível é dramaticamente ilustrada em dois estudos separados nos quais 32 ratos e 33 abelhas foram alimentados com ClO2 em altas doses por dois anos. Nenhum efeito prejudicial foi observado com até 100 ppm adicionado ao abastecimento de água.

Materiais e métodos

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), cultivado em placas de ágar sangue, fornecidas por um laboratório clínico local certificado, foi utilizado neste estudo de pesquisa.

Cultura MRSA

Em um gabinete de Segurança Classe 2, das placas de ágar sangue (Agar Columbian), uma amostra de MRSA foi retirada de culturas isoladas usando uma alça esterilizada e colocada em tubos estéreis com 5 ml de Caldo de Soja Tríptico (TSB). Esses tubos de cultura foram incubados a 37 graus centígrados por 48 horas. Esses tubos de cultura poderiam ser armazenados na geladeira a 4 graus Celsius por até 10 dias, novamente para os quais as amostras seriam feitas.

Contando bactérias

Um dos métodos mais comuns para quantificar bactérias é a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Este método amplamente utilizado é simples, dá uma boa ideia geral da viabilidade celular e é sensível mesmo a baixas concentrações de bactérias.

Uma grande desvantagem é que leva dias para obter resultados que sejam, na melhor das hipóteses, estimativas. Uma colônia pode surgir de uma ou mil células e a preparação da amostra pode variar de tecnologia para tecnologia, bem como de cada vez, dependendo das condições da amostra. Por uma questão de precisão, o contador de células microbianas QUANTOMTx da Logos Biosystems (logosbio.com) foi usado nesta investigação. É um contador de células baseado em imagem automatizado que pode identificar e contar células bacterianas individuais em minutos.

O QUANTOM Tx focaliza, captura e analisa automaticamente várias imagens de células coradas por fluorescência para detectar células bacterianas com alta sensibilidade e precisão. Ele contém um algoritmo sofisticado de detecção e remoção de células que pode identificar com precisão células bacterianas individuais, mesmo nos menores grupos. Nestes experimentos, usamos o Viable Cell Staining Kit para detectar células vivas ou viáveis.

O Quantom Microbial Cell Counter foi comparado e considerado tão preciso quanto as medições de citometria de fluxo e hemocitômetro, mas reduz muito o tempo, pois cada contagem leva não mais que 30 segundos e pode distinguir entre os grupos. As células coradas são misturadas com o tampão de carregamento de células QUANTOM I, carregadas nas lâminas de contagem de células QUANTOM M50 e centrifugadas na centrífuga QUANTOM para imobilizar e distribuir uniformemente as células ao longo de um único plano focal para garantir a detecção precisa consistente das células. Os resultados da contagem e as imagens podem ser visualizados e salvos imediatamente após a contagem.

Para o preparo da amostra para o Quantom, foram retirados 10 microlitros (ul) do meio de cultura com pipeta eletrônica DLAB previamente calibrada e colocados em tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml. A isto foram adicionados 2 µL de corante de coloração de células viáveis ​​e incubados em uma incubadora Heraeus a 37 graus centígrados por 30 minutos. 8 ul de tampão foram adicionados a esta amostra para aumentar o sinal de fluorescência. Para economizar em lâminas consumíveis Quantom, reciclamos lâminas lavando-as nos Sistemas de Limpeza de Lâminas Imrali Inventions iWash® (www.imraliinventions.com).

A esses tubos foi adicionado dióxido de cloro em diferentes concentrações, por diferentes durações? A concentração de dióxido de cloro variou de 0,5 µl (0,5 ppm) a 5 µl (5 ppm), e a duração da exposição à amostra variou de 30 minutos a 30 segundos.

Para cada experimento baseado em tempo e duração, dois tubos de amostra foram preparados para manter o fator de diluição constante. Dependendo da quantidade de dióxido de cloro adicionada ao tubo experimental, a mesma quantidade de água foi adicionada ao tubo controle.

Destes tubos de controle e experimentais, 6 µl da amostra foram retirados com uma pipeta eletrônica e colocados nas lâminas de contagem de células M50. As lâminas foram colocadas na centrífuga QUANTOM por 8 minutos a 300 RCF (força centrífuga relativa) e, em seguida, colocadas no contador de células microbianas Quantom para fazer uma medida de referência (controle) e outra medida do tubo experimental.

A configuração ideal do Quantom Microbial Cell Counter para o protocolo MRSA que encontramos durante o teste foi estabelecida no Fator de Diluição 2, Tamanho mínimo do objeto fluorescente 0.4um, Tamanho máximo do objeto fluorescente 15μm Redondez 50%, Decluster nível 7 e Sensibilidade de detecção 7

Preparação de dióxido de cloro

 

O dióxido de cloro tradicional, denominado MMS, foi preparado como um dióxido de cloro tradicional, denominado MMS, foi preparado como uma solução usando dois componentes, solução de clorito de sódio (solução a 25% em água) e solução de ácido clorídrico a 4%. Uma gota de cada uma dessas soluções foi colocada em um tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml e ativada por 30 segundos. Além disso, mais experimentos foram conduzidos usando uma nova geração de dióxido de cloro chamado CDSplus, um produto patenteado fabricado pela Aquarius Pro-Life como um produto de tratamento de água. Esta é uma forma tamponada de dióxido de cloro em um pH padrão de 7 e uma concentração de 3000 ppm quando ativo (250 ml). Do CDSplus ativado (250 ml), 83 µl = 1 ppm, 166 µl = 2 ppm foram extraídos; 0,25 ml = 3 ppm.

 

Protocolos experimentais

Várias concentrações de dióxido de cloro

MMS e CDSplus foram usados. A faixa foi de 1 ppm a 5 ppm. O tempo de MMS e CDSplus foi usado. A faixa foi de 1 ppm a 5 ppm. O tempo de exposição ao dióxido de cloro variou de 30 minutos a 30 segundos. Nos experimentos iniciais, não estava claro quanto tempo seria necessário para a inibição, mas rapidamente se mostrou menos de um minuto de exposição. A maioria dos experimentos, portanto, teve um tempo de exposição de 1 minuto.

Resultados Experimentos iniciais

Começamos a tomar diferentes concentrações de dióxido de clorobase no MMS tradicional e testamos essas concentrações com MRSA em solução por diferentes tempos, variando de 30 minutos a 30 segundos. 1μl de dióxido de cloro é equivalente a uma concentração de 1 ppm. A concentração mais baixa de dióxido de cloro usada para erradicar completamente o MRSA nesses experimentos foi de 0,5 ppm, com um tempo de exposição de 30 segundos.

A Tabela 1 abaixo mostra as diferentes concentrações em função do tempo, com a concentração de células MRSA medida pelo contador de células Quantom. Como você pode ver, para todas as concentrações de dióxido de cloro variando de 1 a 5 ppm, e o tempo de exposição de 30 minutos a 30 segundos, a inibição do crescimento de MRSA foi de 99,99% ao longo de todas essas experiências.

 

Tabela 1 Comparação das contagens de bactérias antes e depois da exposição ao dióxido de cloro.

 

Experimento 1

A Tabela 2 mostra os números da contagem de células para as 6 concentrações de dióxido de cloro utilizadas, a saber: 0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 ppm foram usados ​​e uma contagem de linha de base foi medida para cada concentração. O experimento número 0 é a contagem de linha de base (controle) para cada grupo de experimento usando diferentes concentrações de dióxido de cloro. Para cada concentração, o experimento foi repetido 5 vezes, com as concentrações médias fornecidas.

Desde os experimentos iniciais, uma vez que o dióxido de cloro matou 99,99% das bactérias MRSA em concentrações de 5 ppm por apenas 30 segundos, todos os outros experimentos usaram um tempo de exposição de um minuto como padrão, enquanto tentavam diferentes concentrações.

Neste experimento, as concentrações de ClO2 variam de 0,5

  • 5ppm foram tomadas, usando o MMS tradicional. Em cada uma das 5 concentrações, a taxa de inibição foi de 100%; consulte a Tabela 2 e a Figura
  1. A Figura 1 mostra a repetibilidade da contagem de bactérias MRSA usando diferentes concentrações variando de 1 a 5 ppm. Uma contagem de linha de base foi feita para cada concentração; isso foi repetido 5 vezes. Em todas as 5 réplicas, a inibição do crescimento de MRSA foi de 100%.

A Figura 2 compara a contagem de células MRSA com a concentração de MMS ao longo de 1 minuto. A área coberta é igual ao número de contagem de células. As contagens iniciais para cada concentração são exibidas no lado esquerdo do gráfico e as contagens finais são exibidas no lado direito do gráfico. A taxa de inibição foi de 100% para todas as concentrações de dióxido de cloro, com tempo de exposição de 1 minuto.

 

Figura 1 Dióxido de cloro em diferentes concentrações usando MMS

 

 

Figura 2 Diferentes concentrações de MMS tradicional por um período de 1 min.

Tabela 2 Dióxido de cloro (MMS tradicional) em diferentes concentrações repetidas 5 vezes

 

 

A Tabela 3 compara as concentrações de 1, 2, 3, 4 e 5 ppm para uma Tabela 3 compara as concentrações de 1, 2, 3, 4 e 5 ppm para uma exposição de 1 minuto ao dióxido de cloro. O controle foi comparado com o experimental para as diferentes concentrações. Para todas essas concentrações de dióxido de cloro, a taxa de inibição foi de 100%.

 

Experimento 2: usando CDSplus

O mesmo experimento anterior foi repetido usando a geração CDS plus, usando concentrações de 1-3 ppm. Em cada uma das 3 concentrações, a taxa de inibição foi novamente 100%; consulte a Tabela 4 e a Figura 3. A Figura 3 mostra a erradicação de células MRSA usando diferentes concentrações de CDSplus, a saber, 1, 2 e 3 ppm. Uma contagem de linha de base foi medida para o grupo de controle e, em seguida, cada concentração de CDS plus foi adicionada e repetida duas vezes.

Para todas as concentrações, a taxa de inibição foi de 100%.

A Tabela 4 compara as concentrações de 1, 2 e 3 pp para uma exposição de 60 segundos ao dióxido de cloro, usando o CDS plus de nova geração.

O controle foi comparado com o experimental para as diferentes concentrações.

 

Figura 3 MRSA-CDSPlus com diferentes concentrações.

 

A Figura 4 compara a contagem de células MRSA com a concentração de dióxido de cloro (CDS plus) por 1 minuto. A linha superior mostra a contagem de células de referência para o grupo de controle. A linha inferior mostra as contagens de células de MRSA após a exposição das células por 1 minuto a diferentes concentrações de dióxido de cloro; a taxa de inibição foi de 100%.

 

 

Figura 4 Diferentes concentrações de CDSPlus por 60 segundos.

Tabela 4 Dióxido de cloro (CDSplus) em diferentes concentrações para uma exposição de 1 minuto Tabela 4 Dióxido de cloro (CDSplus) em diferentes concentrações para uma exposição de 1 minuto

 

Conclusão

MRSA é versátil e imprevisível. Sua adaptabilidade genética e MRSA são versáteis e imprevisíveis. Sua adaptabilidade genética e o aparecimento em série de cepas epidêmicas bem-sucedidas significam que ele continua sendo uma grande ameaça à saúde humana.

A mortalidade persistentemente alta associada à infecção invasiva por MRSA, apesar do fato de o FDA ter aprovado vários antibióticos eficazes contra MRSA desde 2014, destaca a necessidade de estudos de alta qualidade para determinar o tratamento ideal para esses pacientes. Nestes experimentos in vitro, a eficácia do dióxido de cloro contra MRSA foi consistentemente demonstrada, com inibição do crescimento de 99,99% -100% mesmo nas menores concentrações de 0,5 ppm.

Dada a segurança comprovada do dióxido de cloro em experimentos com animais e humanos até o momento, há uma necessidade urgente de ensaios clínicos de alta qualidade para determinar a eficácia do dióxido de cloro em indivíduos infectados com MRSA atualmente.

Esses estudos serão realizados pela comunidade clínica, começando com ensaios clínicos individuais em diferentes países do mundo, com a criação de uma rede de ensaios clínicos para coletar todos os dados e desenvolver protocolos clínicos seguros e eficazes. Com relação à segurança, em um experimento cuidadosamente planejado, o tempo característico necessário para matar um micróbio foi descoberto em apenas alguns milissegundos. Como o ClO 2 é um composto bastante volátil, seu tempo de contato (sua permanência na superfície tratada) é limitado a alguns minutos.

Embora esta estadia seja segura o suficiente (sendo pelo menos 3 ordens de magnitude maior do que o tempo de morte) para inativar todas as bactérias em
a superfície do corpo é muito curta para que o ClO 2 penetre mais profundamente do que alguns décimos de milímetro; portanto, não pode causar nenhum dano real a um organismo muito maior do que uma bactéria. 

 

Também há muitos testemunhos do uso de dióxido de cloro por voluntários humanos para a erradicação de muitas doenças infecciosas, incluindo malária e HIV, mas um dos pioneiros na África, Jim Humble. Há muita controvérsia sobre essa evidência anedótica, mas o número de testemunhas que testemunham não pode ser ignorado: a política e os interesses pessoais devem ser deixados de lado e a ciência deve examinar as evidências para o benefício da humanidade! 34,35

 

Referências e documento original do seguinte link:

 

MRSA

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