Dióxido de cloro em Covid-19:

Hipótese sobre o possível mecanismo de ação molecular na SARS-CoV-2

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Insignares-Carrione, Eduardo. DM * (1) Diretor de Pesquisa Global da LVWWG Liechtensteiner Verein für Wissenschaft und Gesundheit, Suíça-Liechtenstein, 2020. Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você deve habilitar o JavaScript para visualizá-lo.

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Bolano Gómez, Blanca. Doutor em Medicina (2) Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você deve habilitar o JavaScript para visualizá-lo.Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você deve habilitar o JavaScript para visualizá-lo.

Kalcker, Andreas Ludwig (3) Pesquisador Swiss SVNB Biphysic Diretor Administrativo Liechtensteiner

Verein für die Wissenschaft und Gesundheit 

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* autor para correspondência (1) (+34) 666667180

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Citação: 

Insignares-Carrione E, Bolano Gomez B, Kalcker Andreas. (2020). 

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 Direitos autorais: © 2020 Insignares - Carrione et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído nos termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados. A ser definido pelo editor.

Dinheiro: Este trabalho foi apoiado com recursos próprios dos pesquisadores.

Conflito de interesses: Kalcker, Andreas declara um possível interesse financeiro por ser o inventor da patente suíça pendente / 11136-CH. Os outros dois autores não têm interesses econômicos concorrentes. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas sobre a troca de dados e materiais. 

Introdução

O ClO2, o chamado "biocida ideal", também poderia ser aplicado como um viricida, se se entendesse como a solução mata os vírus rapidamente sem causar nenhum dano a humanos ou animais. Nosso objetivo foi encontrar o mecanismo de ação dessa seletividade estudando seu mecanismo de reação com a estrutura do SARS-CoV-2 teórica e experimentalmente, por simulação in silico.

Métodos

Revisões extensivas de pesquisas anteriores sobre o mecanismo de ação do ClO2 em vírus, particularmente sars-cov e vírus influenza, foram conduzidas no nível de aminoácidos e carboidratos componentes, especialmente no pico viral, e esses dados foram transferidos para aminoácidos estruturais de SARS-CoV-2 vírus, particularmente aqueles em posições críticas dentro do pico de SARS-CoV-2. Os dados preliminares da simulação em sílica e os dados iniciais de nossos ensaios clínicos do uso de Cl02 em covidora 19 que estão em andamento, nos permitem calcular em quais aminoácidos ele atua, determinar os locais de ação do ClO2 e estimar ações como virucida em SARS-CoV-2, com base em equações de reação-difusão demonstradas em estudos anteriores. Nós usamos Reconstruções 3D feitas por computador, utilização de dados por meio de estudos em cromicroscopia eletrônica e trabalhos anteriores baseados no software de realidade aumentada ChimeraX (UCSF).

Discussão.

A determinação das posições dos aminoácidos suscetíveis de serem oxidados pelo dióxido de cloro permite projetar seu possível mecanismo de ação sobre o vírus SARS-CoV-2. A cisteína nas posições Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 e Cys391-Cys525 estabilizam as cinco folhas beta (β1, β2, β3, β4 e β7) e Cys480-Cys488 é a chave na união entre a crista SARS-CoV-2

RBM e a hélice N-terminal de hACE 2. É claro que, apenas a este nível, a oxidação destes resíduos de cisteína produziria um efeito desestabilizador e prejudicial nas folhas beta do vírus.

Resultados

A projeção e simulação da oxidação do dióxido de cloro nos aminoácidos estruturais do SARS-CoV-2 sobre os quais exerce esta ação, em mais do que o seu número (54 tirosina, 12 triptofano, 40 resíduos de cisteína, além de prolina), permite uma ideia muito clara dos locais onde o dióxido exerce ação desnaturante na estrutura viral e na ECA2 humana. Aplicando os achados da velocidade de reação e difusão do dióxido sobre esses aminoácidos, é possível entender a extrema velocidade com que ele atua, o que poderia explicar os primeiros achados de estudos clínicos observacionais do uso do dióxido de cloro em covid19 realizados pelos autores em Bolívia em estrito cumprimento do comitê de ética.

Conclusão

Conhecer a disposição dos locais em que os aminoácidos sensíveis à oxidação pelo dióxido de cloro estão localizados na proteína spike do coronavírus SARS-CoV-2 que contém 54 tirosina, 12 triptofano, 40 resíduos de cisteína, além disso da prolina presente na estrutura da ACE2 em conexão com RBD, permite projetar as ações do dióxido sobre o pico viral.Esperamos publicar ensaios de aplicação clínica deste promissor virucida sistêmico em breve.

introdução:

Covid-19 é uma doença infecciosa causada pelo vírus SARS-CoV-2. Foi detectado pela primeira vez na cidade chinesa de Wuhan (província de Hubei) em dezembro de 2019. Em três meses se espalhou para praticamente todos os países do mundo, razão pela qual a Organização Mundial de Saúde declarou que é uma pandemia. (OMS, 11 de março de 2020).

Não existe tratamento específico; as principais medidas terapêuticas são o alívio dos sintomas e a manutenção das funções vitais. A pesquisa para encontrar um tratamento eficaz começou desde que a escala de pandemia da doença foi verificada. O problema central é que, onze meses após seu início oficial, não se conhece um tratamento eficaz para a doença. Na ausência de um tratamento eficaz, estudamos novas possibilidades terapêuticas com o intuito de encontrar um tratamento eficaz e seguro para covid19.

De acordo com o exposto, esta pesquisa aborda resultados atuais e pesquisas anteriores [1] adicionando a possível ação terapêutica do dióxido de cloro como um virucida em solução aquosa e sem a presença de clorito de sódio usando os conceitos de medicina translacional [2] no conhecimento da estrutura do vírus e do mecanismo de ação do dióxido de cloro nos vírus, propor um possível tratamento de escolha para o covid19.

Dióxido de cloro

A ação do dióxido de cloro é dada por sua seletividade pelo pH(3) e pela área ou tamanho onde gera sua ação. Isso significa que essa molécula se dissocia e libera oxigênio quando entra em contato com outro ácido. Ao reagir, seu átomo de cloro se liga ao sódio do meio e se transforma em cloreto de sódio (sal comum), liberando oxigênio, que oxida os patógenos de pH ácido presentes, convertendo-os em óxidos alcalinos. Portanto, quando o dióxido de cloro se dissocia, ele libera oxigênio no sangue, como fazem os eritrócitos (glóbulos vermelhos) pelo mesmo princípio (conhecido como efeito Bohr), que é ser seletivo para a acidez.

Como normalmente acontece no sangue, o dióxido de cloro libera oxigênio quando encontra solo ácido, seja o ácido lático ou a acidez do patógeno. Seu possível efeito terapêutico é postulado devido, entre outros efeitos, ao fato de criar um ambiente alcalino, ao mesmo tempo em que elimina pequenos patógenos ácidos, por oxidação, com uma sobrecarga eletromagnética impossível de dissipar pelos organismos unicelulares. O tempo de morte em um vírus deve ser análogo ao tempo de latência causado pela reação química, devido aos tempos necessários para cobrir todo o volume. Podemos esperar que, em um vírus com diâmetro de 120 nanômetros, o tempo de destruição seja muito menor devido ao seu fator geométrico.

De acordo com estudos de Zoltán Noszticzius, o dióxido de cloro é um agente antimicrobiano com seleção de tamanho que pode matar rapidamente organismos do tamanho de um micrômetro, mas não pode causar danos reais a organismos muito maiores, como animais ou humanos, pois não pode penetre profundamente em seus tecidos.

Sabe-se que o tecido multicelular possui a maior capacidade de dissipar cargas elétricas e, portanto, não é afetado da mesma forma pelas tensões do processo de oxidação-redução (ORP) como é o caso dos organismos unicelulares e, portanto, existe bioquimicamente maior proteção celular por tamanho.

O dióxido de cloro, que é o desinfetante não citotóxico mais eficaz conhecido depois do ozônio, e utilizado como solução aquosa, tem imensas possibilidades de uso terapêutico, pois também é capaz de penetrar e eliminar o biofilme (3), o que o ozônio não atinge. Faz. A grande vantagem do possível uso terapêutico do dióxido de cloro em infecções é a impossibilidade de resistência bacteriana ou viral ao ClO2, pois ele atua pelo mecanismo de oxidação e não como o cloro (Cl2) pela cloração (3)

Embora o ozônio seja mais forte em termos anti-sépticos, seu alto potencial oxidativo de 2,07 e sua meia-vida curta de apenas 15 minutos a 25 ° C com um valor de pH de 7,0 o torna menos eficaz do que o ClO2 para aplicações terapêuticas. na Vivo. O dióxido de cloro é um oxidante seletivo para pH (-) e tamanho e, ao contrário de outras substâncias, não reage com a maioria dos componentes do tecido vivo (3). O dióxido de cloro reage rapidamente com fenóis e tióis essenciais para a vida bacteriana.

Nos fenóis, o mecanismo consiste em atacar o anel benzênico, eliminando odor, sabor e outros compostos intermediários (4). O dióxido de cloro mata os vírus com eficácia e é até 10 vezes mais eficaz (5) do que o hipoclorito de sódio (alvejante ou alvejante). Também se mostrou muito eficaz contra pequenos parasitas, protozoários (4).

Um tópico que tem sido muito revisado ultimamente é a reatividade do dióxido de cloro com os aminoácidos. Em testes de reatividade do dióxido de cloro com 21 aminoácidos, apenas cisteína4, triptofano5tirosina6, prolina e hidroxiprolina reagiram a um pH de cerca de 6. Cisteína e metionina (4) são dois aminoácidos aromáticos contendo enxofre, triptofano e tirosina e os dois íons inorgânicos Fe2 + e Mn2 +. (3) A cisteína, por pertencer ao grupo dos tióis, é um aminoácido até 50 vezes mais reativo com todos os sistemas microbianos do que os outros quatro aminoácidos e, portanto, é impossível criar resistência ao dióxido de carbono. cloro.

A hipótese que propomos aqui é que a causa do efeito antiviral do dióxido de cloro pode ser explicada por suas ações em pelo menos cinco aminoácidos listados acima ou em resíduos de peptídeos.

O dióxido de cloro (ClO2) é utilizado desde 1944 no tratamento de água potável devido ao seu poder biocida, bem como na maioria das águas engarrafadas adequadas ao consumo devido à sua quase zero ausência de toxicidade em solução aquosa (3,4) sendo utilizado de forma sistemática na desinfecção e conservação de bolsas transfusionais de sangue (4). Por ser um oxidante seletivo (3,4), seu modo de ação é muito semelhante ao da fagocitose, onde um leve processo de oxidação é utilizado para eliminar todos os tipos de patógenos.

O dióxido de cloro (ClO2) é um gás amarelado que até hoje não faz parte da farmacopéia convencional como medicamento apesar de sua eficácia comprovada em desnaturar vírus, com múltiplas patentes para uso em diferentes tratamentos como desinfecção ou esterilização de componentes do sangue (células do sangue, proteínas do sangue, etc.) 4, o tratamento parenteral (via intravenosa) de infecções por HIV (4) ou para o tratamento de doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ELA), Alzheimer (4) ) e outras patentes para usos, como patentes para: tratamento de câncer por indução de apoptose (CN 103720709

A) Tratamento de tumor (US 10, 105, 389 B1) Tratamento antiviral de sinusite (US 2o16 / 0074432 A1), estimulação do sistema imunológico (US 5,830,511), iniciação e diferenciação de células-tronco (WO2014082514A1), Método de tratamento vaginal (US 6280716B1), Tratamento da pele contra vírus e bactérias (US 4,737,307), Método para o tratamento de amebíase em humanos (US 4,296,102), Tratamento contra infecções por fungos (US 2015/0320794 A1), Tratamento de feridas (US 87.3106) , Tratamento de cavidades orais (US 100015251), (US4689215), Contra inflamações (US53841134), Tratamentos contra fungos nas unhas (US 20100159031) e Patente Suíça pendente / 11136-CH.(Kalker, A.).

Com base no acima, três premissas podem ser estabelecidas:

1. O dióxido de cloro pode combater os vírus por meio do processo de oxidação seletiva, desnaturando as proteínas do capsídeo e a subsequente oxidação do material genético do vírus, tornando-o desativado. Como não há adaptação possível ao processo de oxidação, torna-se impossível ao vírus desenvolver resistência, tornando o dióxido de cloro (ClO2) um tratamento promissor para qualquer subespécie viral.

2. Há evidências científicas de que o dióxido de cloro é eficaz contra os coronavírus SARS-CoV (4) e SARS-CoV-2, como o trabalho realizado na Universidade de Queretaro, no México e publicado em novembro de 2020 COVID-19, denominado “ Avaliação in vivo do efeito antiviral de ClO2 (dióxido de cloro) em embriões de galinha inoculados com coronavírus aviário (IBV), nos quais o tratamento com ClO2 teve um impacto marcante na infecção por IBV. Nomeadamente, os títulos virais foram 2,4 vezes mais baixos e a mortalidade foi reduzida pela metade em embriões infectados que foram tratados com ClO2. A infecção causou anormalidades de desenvolvimento independentemente do tratamento. Lesões típicas de infecções por IBV foram observadas em todos os embriões inoculados, mas a gravidade tendeu a ser significativamente menor em embriões tratados com ClO2. Nenhuma evidência macro ou microscópica de toxicidade causada pelo ClO2 foi encontrada nas doses usadas. (cinquenta).

3. Toxicidade: Os maiores problemas que surgem com drogas ou substâncias que podem ser consideradas como tais em geral são devido à sua toxicidade e efeitos colaterais. Há toxicidade com o dióxido de cloro em caso de inalação respiratória, mas não há relatos de toxicidade na dose recomendada de 30 mg ou 30 ppm em solução aquosa por via oral e nenhuma morte clinicamente comprovada mesmo em altas doses por ingestão oral. A dose letal (LD50, razão de toxicidade aguda) é estimada em 292 mg por quilo por 14 dias, sendo que seu equivalente em um adulto de 50 kg seria 15.000 mg administrados em duas semanas. As doses orais subtóxicas que podem ser utilizadas são de aproximadamente 50 ppm dissolvidos em 100 ml de água 10 vezes ao dia, o que equivale a 500 mg. Além disso, o dióxido de cloro, após a dissociação, se decompõe em um íon de cloro que se associa imediatamente ao íon de sódio, formando o sal comum NaCl e o oxigênio O2 no corpo humano. Em resumo, o dióxido de cloro nas doses recomendadas no COVID19 de 30 mg ou 30 ppm por dia não são tóxicos.

Efeitos virucidas do dióxido de cloro

O dióxido de cloro é um agente antimicrobiano eficaz que mata bactérias, vírus e alguns parasitas [9]. Seu perfil germicida de amplo espectro é derivado da ação desse composto como oxidante não citotóxico. 

Os vírus geralmente consistem em uma camada externa ou um revestimento de proteína que encapsula um ácido nucleico, que pode ser DNA ou RNA. Quando o dióxido de cloro entra em contato com um vírus, um único átomo de oxigênio nascente altamente reativo é liberado no vírus alvo. Esse oxigênio se liga a aminoácidos específicos na capa protéica do vírus, desnaturando as proteínas e tornando o vírus inativo. Além disso, os átomos nascentes de oxigênio se ligam à guanina, uma das quatro bases de ácido nucléico encontradas no RNA e no DNA, formando a 8-oxoguanina. Esta oxidação de resíduos de guanina impede a replicação do ácido nucleico viral [10].

Na literatura científica publicada, há relatos de que o dióxido de cloro inativa uma ampla variedade de vírus, incluindo influenza A [11], adenovírus humano [12], rotavírus humano [13], ecovírus [14], bacteriófago f2 [15] e poliovírus [16].

Os vírus da influenza A são vírus de RNA esféricos, de sentido negativo e de fita simples, que possuem uma membrana lipídica que contém picos compostos por glicoproteínas conhecidas como HA (hemaglutinina) e NA (neuraminidase). Dentro do vírus, existem oito fitas simples de RNA [17]. Um estudo pré-clínico [11] descobriu que o gás dióxido de cloro é eficaz na prevenção da infecção pelo vírus influenza A induzida por aerossol. Este estudo usou baixas concentrações de gás dióxido de cloro (ou seja, 0,03 ppm) em uma gaiola de camundongo. Este nível está abaixo do nível de exposição de longo prazo da OSHA (8 horas) para o gás dióxido de cloro no ar ambiente em um local de trabalho humano, que é 0,1 ppm [18]. O gás dióxido de cloro reduziu efetivamente o número de vírus infecciosos nos pulmões dos camundongos e reduziu significativamente a mortalidade. A mortalidade foi de 70% (7/10) no dia 16 no grupo não tratado com dióxido de cloro e 0% (0/10) no grupo tratado com dióxido de cloro. Os autores confirmaram esses resultados repetindo seu experimento. o

Os resultados do estudo de repetição foram 50% (5/10) de mortalidade no grupo não tratado e 0% (0/10) no grupo tratado.

Os autores concluíram que níveis baixos de gás dióxido de cloro (ou seja, 0,03 ppm), que estão abaixo do nível de exposição permitido em locais de trabalho humanos, "poderiam ser usados ​​na presença de humanos para prevenir sua infecção por vírus influenza A e possivelmente outros vírus associados a infecções do trato respiratório (pág. 65).Eles sugeriram que "o gás dióxido de cloro poderia ser usado em locais como escritórios, teatros, hotéis, escolas e prédios de aeroportos sem evacuar as pessoas, sem interromper suas atividades normais."

Os autores sugeriram que seu método "abre um novo caminho para a prevenção da pandemia de influenza" (p. 65) após a realização de um estudo em uma escola com resultados favoráveis ​​a esse respeito.

A infectividade do vírus foi reduzida in vitro pela aplicação de dióxido de cloro, e concentrações mais altas produzem reduções ainda maiores. Esta inibição da infectividade foi correlacionada com alterações nas proteínas virais. Essas alterações resultaram da incorporação de átomos de oxigênio nos resíduos de triptofano e tirosina localizados nas proteínas HA e NA [11]. Essas proteínas são desnaturadas pela adição de átomos de oxigênio, o que elimina a capacidade do vírus de infectar outras células [19]. Um estudo posterior descobriu que a inativação do vírus influenza A é causada pela transferência de 2 átomos de oxigênio do dióxido de cloro para um resíduo específico de triptofano (W153) na proteína da ponta da hemaglutinina (HA).

Os adenovírus são vírus sem envelope com um capsídeo icosaédrico contendo um genoma de DNA de fita dupla. Sete grupos de adenovírus humanos foram classificados [21]. Um estudo recente descobriu que o dióxido de cloro pode ajudar a reduzir os níveis de adenovírus na água potável [12]. Este estudo examinou os efeitos do dióxido de cloro e da luz ultravioleta nos níveis de adenovírus na água potável na Holanda. Os autores encontraram

que a aplicação de dióxido de cloro em baixas concentrações (0.05 - 0.1 ppm) reduziu os adenovírus na água potável, enquanto a desinfecção por UV foi insuficiente sem a desinfecção com dióxido de cloro.

Os rotavírus são vírus de RNA de fita dupla que consistem em 11 moléculas únicas de RNA de fita dupla rodeadas por um capsídeo de proteína icosaédrica de três camadas [22]. Esses vírus, que são a principal causa de doenças diarreicas graves em bebês e crianças pequenas em todo o mundo [23], são inativados pelo dióxido de cloro. Na verdade, em concentrações de dióxido de cloreto variando de 0,05 a 0,2 ppm, eles são inativados em 20 segundos in vitro [24].

O bacteriófago f2 é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo que infecta a bactéria Escherichia coli. Um estudo in vitro descobriu que 0,6 mg / litro de dióxido de cloro rapidamente (ou seja, em 30 segundos) inativou o bacteriófago f2 e interferiu com sua capacidade de se ligar ao seu hospedeiro, E. coli [15]. Tanto a inativação do vírus quanto a inibição de sua capacidade de se ligar ao hospedeiro aumentaram com o aumento do pH e com o aumento das concentrações de dióxido de cloro. Além disso, os autores descobriram que o dióxido de cloro desnatura as proteínas do capsídeo do vírus ao reagir com resíduos de tirosina, triptofano e cisteína. Esses aminoácidos foram quase completamente degradados em 2 minutos após a exposição ao dióxido de cloro.

O poliovírus é um vírus de RNA de fita positiva de sentido positivo [25]. Ridenour e Ingerson [26] descobriram que o dióxido de cloro pode inativar o vírus da poliomielite in vitro. Posteriormente, Álvarez e O'Brien [16] expandiram este trabalho mostrando que o tratamento com 1 ppm de dióxido de cloro in vitro resulta na separação do RNA do capsídeo e também produz alterações no RNA.

Além dos estudos mencionados acima, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), que em 10 de abril de 2020 listou o dióxido de cloro como um desinfetante registrado pela EPA para matar o vírus SARS-CoV-2 , fornece suporte adicional

para os efeitos virucidas do cloro [27]. O site da EPA indica que este produto é para uso superficial e não para uso humano. 

Ainda não foram realizados estudos em humanos sobre os efeitos do dióxido de cloro no vírus SARS-CoV-2. Atualmente, dois dos autores (Insignares e Bolano) estão conduzindo o primeiro ensaio clínico multicêntrico do mundo sobre a eficácia do dióxido de cloro oral em humanos em covid19. (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT04343742). Um estudo in vitro descobriu que o dióxido de cloro inativa o vírus SARS-CoV geneticamente relacionado [28]. Uma concentração de 2,19 mg / litro de dióxido de cloro causou a inativação completa do SARS-Co-V em águas residuais. Uma filial de nosso grupo está conduzindo uma investigação in vitro da ação do dióxido de cloro no SARS-CoV-2 na Índia e estamos publicando um relatório sobre a simulação do mecanismo de ação do dióxido de cloro em SARS-Co-V-2 utilizando o método in silico, realizado no Japão.

No Equador (Aememi. Dióxido de cloro: uma terapia eficaz para o tratamento de covid 19; 51) Um ensaio preliminar foi realizado com a administração de dióxido de cloro oral em 104 pacientes com covid19 que apresentavam perfis variáveis ​​em termos de idade, sexo e gravidade da doença, a minoria diagnosticada por testes e a maioria por rastreamento de acordo com os sintomas típicos da doença. Portanto, os dados foram gerenciados usando uma escala de pontuação sintomatológica, com 10 sendo a percepção máxima e 0 sendo o mínimo do sintoma: febre, calafrios, dor muscular, tosse seca, dor de cabeça, dor nas costas, dificuldade para respirar, vômitos, diarréia. , dor de garganta, perda do olfato, perda do paladar, falta de apetite.

O dióxido de cloro na concentração de 3000 ppm foi preconizado na dose de dez cc diluído em um litro de água, ao longo do dia, dividido em 10 doses diárias, em doses a cada hora e meia durante 20 dias.

Os resultados foram distribuídos de acordo com os sintomas após o primeiro, segundo, terceiro e quarto dias de tratamento. Eles foram segmentados entre homens e mulheres, e resultados comuns também foram apresentados.

As tabelas a seguir mostram os sintomas, e no primeiro e no último gráfico o comportamento em relação à escala sintomatológica entre o primeiro e o quarto dia de ingestão de dióxido de cloro por via oral.

Tabela 1: Resultado do dióxido de cloro no dia 1 de sua administração

Tabela 2: Resultado do dióxido de cloro no dia 4 de sua administração

Deste estudo preliminar podem-se tirar as seguintes conclusões: O dióxido de cloro é definitivamente inofensivo - não é tóxico - nas doses recomendadas e ingeridas e todos os sintomas iniciais começaram a diminuir a partir do primeiro dia de tratamento, sendo a diminuição totalmente evidente No quarto dia. Especificamente, os sintomas mais indicativos de uma infecção contínua, como febre, calafrios, dor de cabeça, dor de garganta, perda de apetite e perda dos sentidos do paladar e do olfato, diminuíram drasticamente. Outros sintomas, como dores musculares e tosse, permaneceram um tanto comuns, pois tendem a permanecer residuais por mais tempo após o término da doença.

Materiais e métodos:

Para a busca das informações de referência utilizadas neste artigo, os buscadores da web foram revisados ​​utilizando o critério MesH, de acordo com a estratégia de busca indicada nas linhas subsequentes nos períodos entre janeiro e abril de 2020, encontrando os seguintes resultados: 1. PubMed (Medline): 4 referências, 2. LILACS: 18 referências, 3.

Biblioteca Cochrane: 56 referências, 4. Ciência: 1.168 referências, 5. Scielo: 61 referências, 6. MedScape: 19 referências para um total de 1.326 publicações científicas cujos conteúdos eram sobre o uso de dióxido de cloro em diferentes aplicações e sobre o mecanismo de ação do dióxido de cloro sobre os vírus sars-cov e sars-cov2.

Finalmente, revisamos os registros em www.clinicaltrials.gov e aqueles da Plataforma Internacional de Registro de Ensaios Clínicos da OMS (ICTRP), a fim de identificar ensaios clínicos em andamento ou não publicados.

Estratégia de pesquisa:

"Dióxido de cloro" OU "Protocolo de dióxido de cloro" OU Dióxido de cloro E vírus; Dióxido de cloro Y SAR-COV-2; OU "COVID-19 tratamento com drogas" OU "glicoproteína de pico, vírus COVID-19" OU "síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2" OU "COVID-19" OU "2019-

nCoV "O" SARS-CoV-2 "O" 2019 novo coronavírus "OU" 2019 coronavírus doença "O (pneumonia).

Dos resultados da pesquisa, selecionamos aqueles que faziam referência à ação virucida do dióxido de cloro sobre vários microrganismos, em particular sobre os vírus e, neles, o SARS-CoV-2 ou o SARS-CoV.

Também revisamos os estudos realizados sobre a ação do dióxido de cloro sobre os aminoácidos, principalmente aqueles que fazem parte das cápsides virais. Dos achados destacamos que, em 1986, Noss et al. demonstraram que a inativação do vírus bacteriano (bacteriófago) f2 pelo ClO2 [29] foi devido às suas reações com as proteínas do capsídeo viral. Além disso, eles descobriram que três aminoácidos da proteína viral [29], a saber, cisteína, tirosina e triptofano, poderiam reagir com ClO2 rapidamente. Em 1987, Tan e outros testaram a reatividade do ClO2 em 21 aminoácidos livres [30]. O ClO2 reagiu com apenas seis aminoácidos dissolvidos em tampão de fosfato de sódio 0,1 M em pH 6,0. A reação com cisteína, triptofano e tirosina foi muito rápida para ser seguida por sua técnica.

A reatividade dos três aminoácidos de reação rápida (cisteína [31], tirosina [32] e triptofano [33) foram estudados em laboratório entre 2005 e 2008, descobrindo que a cisteína tinha a maior reatividade entre esses aminoácidos.

Em 2007, Ogata [34] descobriu que a atividade antimicrobiana do ClO2 é baseada na desnaturação de certas proteínas, que se deve principalmente à modificação oxidativa dos resíduos de triptofano e tirosina das duas proteínas modelo (albumina de soro bovino e glicose - 6-fosfato desidrogenase) utilizados em seus experimentos. Em 2012, foi novamente Ogata quem demonstrou [35] que a inativação do vírus da influenza pelo ClO2 foi causada pela oxidação de um resíduo de triptofano (W153) em hemaglutinina (uma proteína do pico do vírus), suprimindo assim sua capacidade de se ligar a receptores ..

Nesse contexto, é interessante notar que a proteína spike do novo coronavírus SARS_CoV-2 contém 54 resíduos de tirosina, 12 de triptofano e 40 de cisteína [36].

Se assumirmos que em uma solução aquosa todos esses resíduos de aminoácidos são capazes de reagir com ClO2 assim como com aminoácidos livres, a inativação do vírus pode ser extremamente rápida mesmo em uma solução de 0,1 mg / L de ClO2.

Por outro lado, selecionamos os artigos que descrevem a ação do SARS-CoV-2 nas células, em sua interação com a ACE2 e, em particular, investigamos vídeos de realidade aumentada ou vídeos de simulação baseados em Silico, para a representação tridimensional de sites ação como vídeos em que a proteína espicular e o receptor ACE2 (37), entre outros, são manipulados com o software de realidade aumentada ChimeraX (UCSF). (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44).

Da mesma forma, revisamos a estrutura do pico do vírus e com base na pesquisa de Daniel Wrapp e Jason S. McLellan, da Universidade do Texas.

A imagem tridimensional da glicoproteína S espicular do betacoronavírus SARS-CoV-2 foi vista com criomicroscopia eletrônica em tempo recorde. Graças a esta imagem com resolução de 3,5 Å, confirma-se que esta proteína S está acoplada à proteína hACE2 de células humanas com afinidade superior à do coronavírus SARS-CoV. A proteína S é o alvo dos anticorpos que nos imunizam. Sua estrutura 3D permite entender por que os anticorpos monoclonais publicados contra o SARS-CoV não são eficazes contra o SARS-CoV-2. Sem dúvida, ajudará a acelerar o desenvolvimento de vacinas e terapias contra a infecção por COVID-19. (Quatro cinco),

Nesses vídeos de simulação e realidade virtual, observa-se que a proteína S é um trímero composto por três peptídeos, cada um com duas subunidades S1 e S2. A subunidade S1 atua como uma dobradiça com duas conformações chamadas "para baixo" (RBD para baixo) e "para cima" (RBD para cima). A imagem da criomicroscopia eletrônica mostra que apenas um dos peptídeos está no estado "para cima", enquanto os outros dois estão no estado "para baixo". A ligação ao receptor celular ocorre na configuração "a montante". Após a ligação, os três péptidos da proteína S são clivados no local S1 / S2; em seguida, ocorre uma segunda clivagem no ponto S2 ', desdobrando o peptídeo de fusão chave (FP) na junção entre as membranas.

Discussão

A proteína espicular (S) é uma proteína trimérica transmembrana do tipo I com entre 1.160 e

1.400 aminoácidos, dependendo do tipo de coronavírus. Esta proteína forma a coroa do coronavírus; É composto por três peptídeos repetidos e é altamente glicosilado, o que facilita sua ligação a proteínas e açúcares. Cada peptídeo é composto por dois domínios chamados S1 e S2. Em beta coronavírus como o SARS-CoV-2, a clivagem das subunidades S1 e S2 ocorre durante a fusão entre as membranas.

O domínio S1 tem dois subdomínios, um N-terminal (NTD), que termina com um aminoácido que tem um grupo amino livre (-NH2), e outro C-terminal (CTD), que termina com um grupo carboxil ( -COOH); ambos se ligam ao receptor ACE2 da célula hospedeira, então eles são domínios de ligação ao receptor (RBD). O domínio S2 é do tipo C-terminal e é altamente conservado entre todos os coronavírus, que diferem muito mais na subunidade S1. O domínio S2 contém duas regiões, HR1 e HR2, nas quais se repetem grupos de sete aminoácidos (chamados heptides), na forma abcdefg, que contêm resíduos hidrofóbicos a e d que participam da fusão entre as membranas. Os domínios HR1 e HR2 são alvos terapêuticos, visto que são conhecidos fármacos que inibem sua ação, impedindo ou dificultando a fusão.

A infecção das células epiteliais do trato respiratório é orquestrada pela proteína S do vírus. Nas etapas gerais do processo de fusão primeiro, o domínio S1 reconhece e se liga ao receptor da célula hospedeira. Em segundo lugar, existe uma primeira clivagem nos domínios S1 e S2 e uma segunda clivagem no local S2 '; o último permite que o peptídeo de fusão (FP) que conecta as membranas do hospedeiro e do vírus seja ativado (esta fase é chamada de estágio intermediário de fusão ou estágio intermediário de fusão). E em terceiro lugar, a região entre HR1 e HR2 se remodela (dobra) dando origem a um heptâmero (6-HB) que une ambas as membranas permitindo a entrada do vírus. A proteína S dos coronavírus é fundamental para o desenvolvimento de vacinas (antígenos que induzem uma resposta imune à presença do domínio S1) e para o desenvolvimento de antivirais (inibidores de alguns dos estágios de fusão entre membranas, normalmente atacando regiões específicas do domínio S2). Conhecer a estrutura tridimensional da proteína S é essencial para combater a epidemia de COVID-19.

A sequência da proteína S do SARS-CoV-2 coincide 98% com a proteína S do coronavírus Bat-RaTG13, com a grande diferença de possuir quatro aminoácidos RRAR (arginina-arginina-alanina-arginina) em vez de apenas um arginina (R). Além disso, eles diferem em 29 resíduos, 17 dos quais estão na região RBD. A comparação feita entre os 61 genomas completos do SARS-CoV-2 disponíveis no GISAID (Global Initiative to Share All Influenza Data) mostra que existem apenas 9 aminoácidos diferentes entre todos eles; e todas essas variantes são encontradas em locais muito bem preservados, o que não parece afetar a letalidade do coronavírus.

Primeiramente, foi possível caracterizar a estrutura 3D da glicoproteína S espicular do coronavírus SARS-CoV-2 e seu domínio de ligação ao receptor RBD. Depois, o receptor da célula hospedeira, a enzima conversora de angiotensina humana hACE2. O próximo passo dos pesquisadores foi determinar a estrutura do complexo SARS-CoV-2 RBD / hACE2, que foram obtidos por cristalografia de raios-X, atingindo resoluções de 2,45 Å e 2,68 Å. Entre as descobertas, foi determinado que mudanças estruturais muito sutis explicam a maior infectividade e patogênese do SARS-CoV-2 (COVID-19) em comparação com o SARS-CoV (SARS);

Esses achados são de grande relevância para o desenvolvimento de drogas para combater COVID-

19. Reconstruções in silico foram realizadas (usando modelos teóricos usando computadores), mas a observação da estrutura cristalográfica real por difração de raios-X é essencial. Conforme observado no início, os autores estão em processo de publicação do estudo in silico baseado no Japão que conduziram sobre o mecanismo de ação do dióxido de cloro no pico SARS-CoV-2 e na hemoglobina.

O primeiro problema que surge no processo de pesquisa é como formar o complexo SARS-CoV-2 RBD / hACE2 com estabilidade suficiente para sua observação; A experiência anterior na formação do complexo SARS-CoV RBD / hACE2 (evidenciado em 2005) foi fundamental, em que uma ponte de sal entre Arg426 de RBD e Glu329 de hACE2 é usada para reforçar a ligação do complexo. Uma observação muito importante é que a cisteína nas posições Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 e Cys391-Cys525 estabilizam as cinco folhas beta (β1, β2, β3, β4 e β7) e Cys480-

Cys488 é a chave na junção entre a crista SARS-CoV-2 RBM e a hélice N-terminal de hACE2 (46), (47), (48).

Quando a simulação da ação do dióxido sobre esses aminoácidos ( Cis ), é fácil compreender o fabuloso efeito virucida direto do dióxido sobre os vírus e, em particular, sobre a SARS-CoV-2.

A imagem que se revela é a de um efeito devastador do dióxido sobre o vírus, degradando-o e desnaturando-o.

A comparação entre os complexos SARS-CoV RBD / hACE2 e SARS-CoV-2 RBD / hACE2 fornece informações sobre por que o COVID-19 é mais infeccioso do que o SARS-CoV.

SARS-CoV-2 RBM forma uma interface de junção maior e mais altamente contatada com hACE2 do que SARS-CoV RBM; A ponte de sal entre o SARS-CoV RBD e o hACE2 é mais fraca do que entre o SARS-CoV-2 RBD e o hACE2. A estrutura cristalina do complexo também contém glucanos acoplados aos quatro locais hACE2 e ao local RBD. O glucano acoplado a Asn90 de hACE2 forma uma ligação de hidrogênio com Arg408 no núcleo de RBD; esta interação é conservada entre o SARS-CoV-2 e o SARS-CoV.

As diferenças estruturais entre os RBMs do SARS-CoV-2 e do SARSCoV são sutis, mas afetam as conformações das alças nas cristas de ligação ao receptor. Em ambos os RBMs, uma das ligações de crista contém uma ligação dissulfeto que é crítica para a ligação. SARS-CoV e bat-CoV Rs3367 contêm um motivo com três resíduos de pró-pró-Asa no referido laço; mas em SARS-CoV-2 e bat-CoV RaTG13 eles mostram um motivo de quatro resíduos Gly-Val / Gln-Glu / Thr-Gly; portanto, a conformação do loop muda porque as glicinas são mais flexíveis. Esta alteração favorece a ligação RBD / hACE2. Além disso, a crista tem uma conformação mais compacta graças às ligações de hidrogênio Asn487 e Ala475 no SARS-CoV-2 RBM, trazendo o loop contendo Ala475 para mais perto de hACE2.

O contato da crista de SARS-CoV-2 RBM com a hélice N-terminal de hACE2 é maior do que para SARS-CoV RBM. Por exemplo, o resíduo N-terminal Ser19 de hACE2 forma uma nova ligação de hidrogênio com a estrutura Ala475 de SARS-CoV-2 RBM, e Gln24 da hélice N-terminal de hACE2 também forma um novo contato com SARS-CoV. -2 RBM. Quando comparado com Leu472 de SARS-CoV RBM, Phe486 de SARS-CoV-2 RBM aponta em uma direção diferente e forma uma região hidrofóbica envolvendo Met82, Leu79 e Tyr83 de hACE2.

A comparação com SARS-CoV RBM mostra que essas pequenas alterações estruturais do SARS-CoV-2 RBM são mais favoráveis ​​para a ligação de hACE2. São diferenças sutis, mas muito relevantes do ponto de vista funcional. Dois locais de ligação críticos (pontos de acesso de ligação de vírus) foram revelados, o ponto de acesso-31 crítico na ponte de sal Lys31 e Glu35, e o ponto de acesso 353 em outra ponte de sal entre Lys353 e Asp38. Essas duas pontes de sal são fracas, devido à grande distância na interação, mas por estarem inseridas em um ambiente hidrofóbico, o que reduz a constante dielétrica efetiva, sua energia de ligação é maior.

Fig. 2 Estrutura tridimensional do SARS-CoV-2 Mpro em duas vistas diferentes.

Linlin Zhang et al. Science 2020; 368: 409-412

Copyright © 2020 Os autores, alguns direitos reservados; licenciada exclusiva American Association for the Advancement of Science. Nenhuma reivindicação de obras originais do governo dos EUA.

Distribuído sob uma licença não comercial de atribuição Creative Commons 4.0 (CC BY-NC).

Para confirmar essas conclusões estruturais, estudos bioquímicos da afinidade de ligação de RBD / hACE2 foram realizados após a introdução de certas mutações em SARS-CoV-2 RBD. Essas mutações sugerem que o coronavírus do morcego RaTG13 pode infectar humanos (apoiando a origem zoonótica da epidemia). Além disso, os RBMs de SARS-CoV-2 e bat-COV RaTG13 contêm um motivo semelhante de quatro resíduos na crista de ligação de ACE2, sustentando que um evoluiu do outro. Além disso, para aumentar o reconhecimento de hACE2, o SARS-CoV-2 exibe duas alterações nos resíduos L486F e Y493Q de RaTG13, que parecem ter facilitado a transmissão de SARS-CoV-2 de morcego para humanos. Portanto, pode não haver um hospedeiro intermediário entre o morcego e o humano no COVID-19, ao contrário do que aconteceu com o SARS e o MERS. Claro, por enquanto é impossível descartar a existência de um mediador, que bem poderia ser um pangolim ou outro animal selvagem vendido no mercado de Wuhan; No caso do pangolim, é necessário sequenciar mais genomas do coronavírus do pangolim para esclarecer a questão, mas até o momento uma similaridade genômica de mais de 99% foi evidenciada entre eles. (49)

Resultados e conclusões:

O pico SAR-CoV-2 é fortemente glicosilado e acredita-se que a glicosilação desempenhe um papel importante na detecção do vírus contra nosso próprio sistema imunológico. Uma seção de hélices alfa percorre todo o comprimento da proteína do pico. Na maioria das vezes, as folhas beta estão concentradas nesta extremidade, que é onde a proteína do pico se funde com uma célula para infectá-la. O interessante é que as hélices são constituídas por aminoácidos sensíveis à ação do dióxido de cloro (no nível Cisteína).

A proteína spike é, na verdade, composta de três cadeias entrelaçadas que possuem sequências de aminoácidos idênticas, cada uma dessas cadeias é chamada de protômero. No entanto, os protômeros não têm conformações tridimensionais idênticas.

Podemos ver a diferença na conformação dos protômeros examinando uma seção da proteína spike que é crítica para o ciclo de vida do vírus, o domínio de ligação ao receptor ou RBD. RBD é onde o vírus se liga a uma enzima na superfície das células hospedeiras, permitindo que se funda com a célula e transporte o material genético viral dentro dela. Dois desses RBDs estão em uma conformação inferior na estrutura. No entanto, um desses RBDs vira. Essa conformação "ascendente" é de energia mais alta, pronta para se ligar ao receptor celular e levar à fusão. Acredita-se que quando a proteína spike se liga, cada um desses RBDs é alterado para esta conformação menos estável.

Nossas próprias enzimas, aquelas que quebram as ligações peptídicas chamadas proteases, podem cortar a proteína do pico em locais específicos e ocorrem mudanças conformacionais na fusão da proteína do pico. O RBD está ligado ao ACE2, que é o receptor na superfície da célula ao qual o coronavírus se liga para causar a fusão. Essas estruturas também são fortemente glicosiladas. Se escondermos os açúcares para criar um modelo para entender a interação RBD-ACE2 e colocar dióxido de cloro ali atuando nos aminoácidos, podemos nos concentrar em algumas das interações fracas que mantêm RBD e ACE2 juntos.

Por exemplo, temos uma extensa rede de ligações de hidrogênio na interface RBD-ACE2 que invade dois resíduos de tirosina ( Tyr-489 e Tyr-83 ) Esta cadeia lateral de tirosina também está ligada ao hidrogênio carbonil da cadeia lateral da asparagina (Asn-487), que por sua vez se liga através de seu átomo de hidrogênio NH ao carbonil glutamina em ACE2 (gln- 24). O dióxido de cloro que postulamos oxida esses resíduos Tyr-489 e Tyr-83, entre outros, com os quais a interface RBD-ACE2 é desnaturada e o vírus não pode mais se ligar ou a ligação é oxidada. Além disso, o dióxido também oxida a prolina presente na ACE2, que completa a oxidação e deformação da ACE2.

Movendo-se ao longo da hélice alfa da ACE2, temos a cadeia lateral do glutamato que é desprotonada a um pH de 7,4 e um resíduo de lisina que carrega uma carga positiva naquele pH.

Se o vírus se funde, o material genético viral é liberado na célula. No caso dos coronavírus, esse pedaço de RNA viaja para os ribossomos de nossa célula e os sequestra para criar suas próprias proteínas virais. Uma coisa interessante é que esse RNA viral é capaz de alterar o quadro de três letras das bases do RNA que é lido pelo ribossomo; isso essencialmente duplica a sequência peptídica que pode ser feita a partir de uma réplica viral usando nossos ribossomos - as proteínas de que o vírus precisa para montar cópias adicionais de si mesmo, que eventualmente serão liberadas da célula e infectarão outras pessoas. Há uma proteína importante que é transferida neste processo, e é a principal protease que corta a cadeia de polipeptídeos virais nas proteínas funcionais necessárias para montar novos vírus. Esse é outro objetivo terapêutico, caso o indivíduo já esteja infectado com o vírus, uma vez que pode ser administrado um fármaco que se liga à protease e a impede de formar proteínas virais maduras, para que a replicação viral seja interrompida.

Esta principal protease SAR-CoV-2 é um dímero composto por duas cadeias de proteínas idênticas e deve dimerizar para se tornar uma protease funcional. Existem muitas interações de aminoácidos na interface do dímero, mas os pesquisadores que publicaram esta estrutura cristalina sugerem que as interações iônicas entre a cadeia lateral deste resíduo de arginina

e esta dimerização do glutamato drive. Essa interação está presente em ambos os lados do dímero. Movendo-se em direção ao sítio ativo, os resíduos importantes são constituídos pela cadeia de cisteína (Cis-145) e histidina (His-41).

Esta enzima é uma protease de cisteína, então ela usa cisteína nucleofílica para atacar a ligação amida de um peptídeo. No mecanismo, o nitrogênio da histidina agarra o próton da cadeia lateral da cisteína, permitindo que ele ataque a ligação peptídica.

A ligação peptídica se quebra e, em seguida, uma molécula de água pode entrar, liberando cisteína para que a protease possa quebrar outra cadeia polipeptídica. As enzimas contendo resíduos catalíticos nucleofílicos são excelentes alvos para a inibição irreversível. Como eles contêm uma cadeia lateral de aminoácidos nucleofílicos - cisteína neste caso - podem ser projetados inibidores que se ligam à enzima com uma ligação covalente permanente. O dióxido de cloro também atua aqui, oxidando a cisteína, de modo que esse mecanismo é bloqueado por ele. Ao contrário dos inibidores reversíveis que podem entrar e sair de um local ativo, esses inibidores irreversíveis - também chamados de inibidores suicidas - inativam permanentemente a proteína, impedindo-a de fazer seu trabalho e criando mais proteínas virais. Esses pesquisadores já haviam projetado inibidores para outras proteases de coronavírus. Eles foram capazes de ligar um desses inibidores ao sítio ativo da protease SARS-CoV-2. A serina está claramente envolvida em uma ligação covalente com a cetona do inibidor. Agora, esta é uma reação reversível, então não é um inibidor suicida em si, com a presença da cisteína ligada covalentemente neste sítio ativo. Aqui, este inibidor carbonil é uma ligação de hidrogênio com três grupos NH na proteína. A histidina catalítica da protease também está envolvida nas ligações de hidrogênio. Este anel está envolvido em uma extensa rede de ligações de hidrogênio que envolve os átomos da estrutura e as cadeias laterais. Saber os contatos que um inibidor faz com uma enzima permite que químicos e biólogos considerem as interações e, potencialmente, desenvolvam inibidores ainda melhores. Além da inibição enzimática, que seria uma estratégia eficaz de controle do vírus, o surgimento do dióxido de cloro como uma substância não que inibe, mas que

"Dissolve" por oxidação as estruturas-chave do vírus, permite uma ação com precisão "cirúrgica" quase molecular, sendo, portanto, muito mais eficaz como mecanismo de controle da infecção viral.

Em conclusão, conhecendo a disposição dos locais onde estão localizados os aminoácidos sensíveis à oxidação pelo dióxido de cloro, observando que a proteína spike do coronavírus SARS-CoV-2 contém 54 tirosina, 12 triptofano, 40 resíduos de a cisteína, além da prolina, que por sua vez está presente na estrutura da ACE2 em conexão com a RBD, permite projetar as ações do dióxido sobre o pico viral. O melhor exemplo pedagógico é que o pico é a chave e o ACE2 a fechadura. A deformação da chave por oxidação do dióxido nos aminoácidos cisteína, tirosina, triptofano e prolina, das cadeias de hélice e da oxidação da fechadura (ACE2) impedem não só a união, mas também dissolvem a união existente entre o espigão (RBD) e ACE, muito rapidamente, o que parece explicar a rapidez da ação clínica do uso de dióxido de cloro em pacientes com COVID19.

Reconhecimento:

Queremos expressar nossa gratidão por sua colaboração e contribuições para o médico

Mitchell B. Liester, médico (3) 

Escola de Medicina da Universidade de Colorado Branch em Colorado Springs

Monumento, CO 80132 

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488-0024 (escritório) (719) 338-5719 (cel)

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